利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測頭孢菌素C的生物合成

1、利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測頭孢菌素C的生物合成冀志霞儲炬莊英萍張嗣良【關(guān)鍵詞】頭孢菌素；,反向傳播；,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；,預(yù)測摘要：利用頭孢菌素發(fā)酵過程積累的數(shù)據(jù)，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)估模型，實現(xiàn)以發(fā)酵前期的菌濃和pH對效價的預(yù)測，將此模型應(yīng)用于消費實際，分別通過倒種和改變培養(yǎng)基中碳源組成的方法，使頭孢菌素的合成程度分別進步了118%和157%，說明模型具有較好的預(yù)測功能。關(guān)鍵詞：頭孢菌素；反向傳播；神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；預(yù)測PreditinftheephalsprinbisynthesisbyabakprpagatinneuralnetrkdelABSTRATThebakprpagatin(BP)neuralnetrkde

2、lassetupbyephalsprinferentatindata,andtheprdutivityasfreastedbyPVandpHhangingtendenyfearlyferentatinphase.Thedelasprvedtbeeffetiveandithgdpreditinapaity.Byinreasinginuluandhangingediuarbnsure,theprdutivityfephalsprinferentatinasfurtherinreasedby118%and157%,respetively,hihasellpreditedbytheestablishe

3、ddel.KEYRDSephalsprin;Bakprpagatin;Neuralnetrkdel;Preditin實現(xiàn)發(fā)酵消費過程的優(yōu)化操作和控制，單憑經(jīng)歷或經(jīng)典的試驗數(shù)據(jù)是無法滿足要求的，因此有必要建立模型指導(dǎo)發(fā)酵過程的優(yōu)化，一些難于在線檢測的重要變量、如菌體濃度，底物濃度和產(chǎn)物濃度等可借助于已建立的數(shù)學(xué)模型，通過測量與其相關(guān)的其它可在線測量的變量，如尾氣中的氧和二氧化碳的含量、發(fā)酵液的溫度、pH和溶氧濃度的變化等，得到在線的最優(yōu)化估計。產(chǎn)黃頭孢霉(Areniuhrysgenu)生長與頭孢菌素合成的數(shù)學(xué)模型最早是由atsuura提出來的，建立了頭孢菌素合成與形態(tài)分化，內(nèi)源甲硫氨酸誘導(dǎo)頭孢菌

4、素合成與葡萄糖代謝物阻遏效應(yīng)的構(gòu)造離散型(segregated)模型1。鑒于抗生素發(fā)酵難以建立準確的數(shù)學(xué)模型，無需準確模型的智能控制策略在抗生素發(fā)酵過程控制中得到了應(yīng)用。基于誤差反向傳播(bakprpagatin，BP)算法的多層前向神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(BP網(wǎng)絡(luò))已廣泛用于發(fā)酵工業(yè)的培養(yǎng)基優(yōu)化，連續(xù)攪拌反響器神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)估計，分批發(fā)酵及補料分批發(fā)酵過程建模與控制優(yōu)化25。ruz等建立模型描繪葡萄糖與蔗糖的利用速率與頭孢菌素的合成的關(guān)系，利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以早期的菌濃預(yù)測整個發(fā)酵過程的菌量6。Sliva等運用雜交神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)在線檢測尾氣中二氧化碳和氧的濃度，預(yù)測ephalspriuareniu發(fā)酵過程的菌體濃度，

5、估計細胞的生長速率、底物的消耗速率和產(chǎn)物的生成速率7。李運鋒等利用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的滾動學(xué)習(xí)預(yù)報技術(shù)，實現(xiàn)了頭孢菌素產(chǎn)量、產(chǎn)物質(zhì)量濃度和效益函數(shù)的超前預(yù)報，為發(fā)酵過程的動態(tài)控制和調(diào)度優(yōu)化提供了支持7，8。有關(guān)頭孢菌素的合成已建立了很多模型，而且用發(fā)酵早期的菌濃進展預(yù)測也已有研究，但只用發(fā)酵早期的菌濃預(yù)測后期的菌量，并沒有與產(chǎn)物合成關(guān)聯(lián)起來。在頭孢菌素發(fā)酵過程放大的研究中，發(fā)現(xiàn)菌體早期的生長與產(chǎn)素的關(guān)系親密，因此本文采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)利用發(fā)酵前期的大量數(shù)據(jù)建立效價的預(yù)估模型，實現(xiàn)了對頭孢菌素效價的預(yù)測，同時將該模型應(yīng)用于消費實際。1材料與方法1.1試驗材料1.1.1菌種產(chǎn)黃頭孢霉(Areniuhr

6、ysgenu)A0508由山西威奇達藥業(yè)集團提供。1.1.2培養(yǎng)基(%)糊精50，玉米漿70，豆油10，DL蛋氨酸06，KH2P404，(NH4)2S408，F(xiàn)eS47H20005，a310，消前pH62。1.1.3發(fā)酵罐50L發(fā)酵罐的攪拌槳為六直葉(直徑12)，三層，d/D=036，層間距12，攪拌槳葉尖線速度為12564082/s；1603發(fā)酵罐的攪拌槳四層，六直葉渦輪式攪拌槳，d/D=0375，攪拌槳葉尖線速度為518848/s。1.2試驗方法1.2.1總糖和復(fù)原糖的測定斐林試劑法9。1.2.3尾氣分析尾氣分析使用VGPriadB型質(zhì)譜儀，最后的數(shù)據(jù)處理、通訊和相關(guān)分析通過華東理工大學(xué)國

7、家生化工程技術(shù)研究中心自行開發(fā)的上位機軟件包?發(fā)酵過程檢測系統(tǒng)B10RADAR2.0?完成10。1.2.4頭孢菌素效價測定方法HPL法。色譜柱為TSKgelDS100S(46250，10)；流動相20l/L乙酸銨緩沖液(pH56)乙腈(946)，流速10l/in，紫外檢測波長254n，室溫，進樣量20l。1.2.5菌絲濃度測定濕菌體(PV)采用離心法計算，取10l發(fā)酵液，3000r/in離心15in，計算固形物體積占發(fā)酵液的比例。1.2.6發(fā)酵培養(yǎng)方法三級發(fā)酵。一級種子(種齡76h)二級種子(種齡40h)發(fā)酵，一級種子接入二級種子的接種量為10%，二級種子接入發(fā)酵的接種量為17%；通過壓差法接

8、入，發(fā)酵過程培養(yǎng)130150h左右，培養(yǎng)溫度40h之前28，40h后控制為25。發(fā)酵過程控制根據(jù)實驗情況調(diào)整。補料用硫酸銨、豆油等各自分消，根據(jù)需要獨立補入。2結(jié)果與分析2.1網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模型檢驗在BP網(wǎng)絡(luò)預(yù)估模型的建立中共選取23批發(fā)酵161組數(shù)據(jù)作為樣本，其中18批發(fā)酵的126組數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)樣本，5批發(fā)酵的35組數(shù)據(jù)作為檢驗樣本(Tab.1,Tab.2)。建立三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，三層網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)造由輸入層、隱層和輸出層組成。由于固定了輸入節(jié)點和輸出節(jié)點的個數(shù)及各層數(shù)據(jù)處理函數(shù)，所以隱層節(jié)點數(shù)目將決定網(wǎng)絡(luò)性能。在訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)的過程中，為了獲得最好的訓(xùn)練精度，依次選取1至20個隱層節(jié)點數(shù)。經(jīng)過20000次訓(xùn)練

9、后，得到其相應(yīng)的誤差平方和(SuSquaredErrr，SSE)選取SSE最小的節(jié)點進一步訓(xùn)練，得到最優(yōu)隱層節(jié)點的個數(shù)是2。然后對此BP網(wǎng)絡(luò)再進展60萬次訓(xùn)練，最終使其SSE到達00542，相對誤差為419%。由此建立的BP網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造(Fig.1)由6個輸入節(jié)點、2個隱層節(jié)點、1個輸出節(jié)點構(gòu)成。6個輸入節(jié)點(x1x6)依次代表20、36、44、52h的菌濃(%)，發(fā)酵前期pH最高點與最低點的數(shù)值；輸出節(jié)點y為60h效價(u/l)。為檢測上述建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測才能，BP網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練完成后，用剩余的五組數(shù)據(jù)(冗余數(shù)據(jù))進展驗證，所得驗證結(jié)果如Tab.2所示，SSE為00077，相對誤差分別為-0732

10、3%、15599%、-71026%、-55068%和-20026%。Tab.1略Tab.2略2.2模型應(yīng)用通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測，說明發(fā)酵前期菌濃與pH值的變化是決定效價的關(guān)鍵因素，前期菌濃較高，pH值變化幅度較大效價那么較高。通過建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，可以利用發(fā)酵前期菌濃定量地預(yù)測效價，為進一步優(yōu)化產(chǎn)素程度提供根據(jù)。任何可以引起前期菌濃與pH變化的因素都將影響到效價的上下，比方種子的質(zhì)量、培養(yǎng)基的配比及其消毒溫度、剪切環(huán)境、培養(yǎng)溫度等。Fig.1TplgyfBPneuralnetrk略發(fā)酵前期pH的變化反映了菌體的代謝活性，未加調(diào)控，因此實際操作上考慮從進步菌濃的角度來進步產(chǎn)素程度。2.2.1通過

11、倒種增加接種量增大接種量是進步菌濃的有效、快捷的方法，但由于種子罐的體積已定，無法通過加大種子培養(yǎng)液的體積來增大接種量，因此選擇通過倒種增大接種量，在消費理論中檢驗?zāi)Ｐ偷念A(yù)測才能。將對照與倒種的罐批發(fā)酵前期的菌濃與pH的最高值和最低值輸入模型，預(yù)測60h的效價，結(jié)果見Tab.3，相對誤差為25687%和-93267%，通過倒種法60h效價比對照進步了353%，放罐時效價為33773u/l，比對照進步了118%。2.2.2改變培養(yǎng)基碳源葡萄糖代替糊精50L罐上發(fā)酵消費頭孢菌素倒種法雖然是進步菌量的有效方法，但在實際操作中增大了染菌的風(fēng)險，因此根據(jù)搖瓶實驗的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)，在50L罐上考察葡萄

12、糖局部替代糊精后頭孢菌素的合成，以2%葡萄糖3%糊精代替原配方的5%的糊精，結(jié)果見Fig.2，在發(fā)酵前期pH迅速下降，下降后有兩次反彈，最高值620，最低值56，62h后pH通過流加氨水控制在550。RQ值的變化反映了底物利用的轉(zhuǎn)換，25h之前以葡萄糖和玉米漿中的復(fù)原糖為碳源，RQ值在09左右，之后以糖和豆油為混合碳源，表如今RQ值較之前降低，80h后完成糖與油利用的轉(zhuǎn)換，完全以油為碳源，RQ值穩(wěn)定在0607之間直到放罐。整個發(fā)酵過程D都控制在30%以上，不存在氧限制問題。將對照與葡萄糖代替糊精的罐批早期的菌濃和pH數(shù)據(jù)輸入模型進展預(yù)測和驗證，結(jié)果見Tab.4，相對誤差分別是26876%和52

13、653%。Tab.3略Fig.2略Tab.4略在預(yù)測過程中會出現(xiàn)誤差偏高。網(wǎng)絡(luò)預(yù)測存在偏向是因為微生物的生長和代謝活動嚴密相聯(lián)，發(fā)酵過程非常復(fù)雜，影響因素很多，培養(yǎng)基的配制、消毒過程，以及參數(shù)的檢測等都有可能產(chǎn)生偏向。此外，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立是基于已有數(shù)據(jù)的根底上，通過屢次的訓(xùn)練、學(xué)習(xí)得到的最優(yōu)化結(jié)果，樣本數(shù)據(jù)的類型決定了模型的預(yù)測才能，從如今的結(jié)果看，無論是通過倒種還是用葡萄糖局部替代糊精，由于菌濃與效價的增長很大，實際數(shù)據(jù)與建立模型的樣本數(shù)據(jù)差異較大，這可能是造成模型預(yù)測偏向比擬大的主要原因，需要進一步補充新的樣本數(shù)據(jù)，對模型進展繼續(xù)優(yōu)化，不斷進步效價預(yù)測的精度。分別對兩種碳源發(fā)酵過程的菌

14、濃、效價、前期pH和RQ值進展比擬分析，結(jié)果見Fig.3。葡萄糖代替糊精促進了前期菌的生長，菌量增長優(yōu)于僅以糊精為碳源的罐批，37h時前者菌濃為38%，后者只有30%，培養(yǎng)基中碳源不同，對菌體的形態(tài)和代謝造成很大的影響，pH的變化幅度也不同，代謝活潑的罐批，比方葡萄糖代替糊精的罐批產(chǎn)生大量的有機酸，pH值下降的比擬低，開場pH自動控制的時間早，鏡檢觀察到葡萄糖代替糊精后細長菌絲數(shù)量增多，為進一步菌絲膨大產(chǎn)生大量的粗短菌絲斷片奠定了根底，因此葡萄糖代替糊精后，不管在生長期還是產(chǎn)素期菌濃都比擬高。RQ值的變化表達了頭孢菌素發(fā)酵過程中不同碳源的利用情況，可分為三個階段：60h之前以葡萄糖等易于利用的

15、糖為主要碳源階段；6080h為糖和豆油兩種碳源混合利用及其轉(zhuǎn)換的過渡階段，80h后完全以豆油為碳源階段。兩種培養(yǎng)基RQ值的差異主要表如今60h之前與6080h之間這兩個階段，30h之前RQ值有一峰值，葡萄糖代替糊精的罐批由于培養(yǎng)基中有較多葡萄糖，RQ值的這一峰值出現(xiàn)的時間比僅以糊精為碳源的罐批晚；6080h以葡萄糖代替糊精的罐批先是糖和油被同時利用，之后平穩(wěn)過渡到完全用油，從用糖到用油期間沒有遲滯期；而僅以糊精為碳源的罐批在糖耗盡開場利用油之前有一遲滯期，表如今60h的RQ值比擬高(09)，而且在7090h間有一平臺期。構(gòu)造說明以葡萄糖代替糊精后不僅促進了菌體的生長，還可以實現(xiàn)糖與油利用的平穩(wěn)

16、過渡。產(chǎn)素程度在60h時效價就已出現(xiàn)差異，葡萄糖代替糊精的效價為9556u/l，糊精為唯一碳源的效價為7571u/l，60h后隨著培養(yǎng)時間的延長，效價的增長趨勢不變，放罐時前者的效價為39170u/l，后者為33852u/l，以葡萄糖代替糊精后效價進步了157%。即前期的較高菌濃決定了較高的起步效價，并決定了最終的放罐效價。3結(jié)論建立了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，以發(fā)酵前期的菌體濃度和pH對60h的頭孢菌素效價進展預(yù)測，該模型可以很好地預(yù)測效價，說明發(fā)酵前期的菌濃和pH變化對頭孢菌素的效價起重要作用，模型簡單實用，對實際消費有很大的指導(dǎo)意義。應(yīng)用該模型于實際消費，通過倒種加大接種量的方法進步發(fā)酵前期的菌濃，

17、可以進步發(fā)酵效價11.8%；另外通過改變培養(yǎng)基的成分，以葡萄糖局部替代糊精也能促進發(fā)酵前期的菌濃的增長，到達進步產(chǎn)量的目的(效價進步157%)。將來可進一步考慮改變培養(yǎng)基的消毒方法，如以連消代替實消減少消毒溫度過高對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的破壞作用。菌濃增加后發(fā)酵液的黏度增大，可能會帶來供氧與傳質(zhì)的問題，在實際消費中要加以考慮，進步菌濃應(yīng)以不造成產(chǎn)素期供氧限制為限。Fig.3略參考文獻1atsuura,TadayukiI,TshiiY,etal.delingfephalsprinprdutinanditsappliatintfedbathultureJ.JFerentTehnl,1981,59(2):

18、1152蔡宇杰，諸葛斌，張錫紅，等.遺傳算法與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦聯(lián)法優(yōu)化生淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基J.無錫輕工大學(xué)學(xué)報，200l，20(4)：4213王健，陳寧，楊海軍，等.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的L色氨酸發(fā)酵過程建模J.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2022，18(3)：14assiD,ntagueGA,illisJ,etal.TardsiprvedpeniillinferentatinviaartifiialneuralnetrksJ.heEng,1992,16(4):2835ruzAJG,AraujLG,GirdanR,etal.PhenlgialandneuralnetrkdelingfephalsprinprdutinbipressJ.ApplBiheBitehnl,1998,70(2):5796SilvaRG,ruzAJG,Hkka,etal.Ahybridneuralnetrkalgrithfrnlineinfere