常用免疫組織化學染色方法

1、常用免疫組織化學染色方法g| g（ 一卜ABC法：（注，下面各種方法，均為手工操作，如沒特別說明，均在室溫下進行）1切片經二甲苯I5分鐘。2切片經二甲苯n5分鐘。3無水酒精I 30秒。4無水酒精H 30秒。5.95%酉精I 30秒。6.95%酉精 II 30 秒。7.90%酉精30秒。8.80%酉精30秒。9.70%酉精30秒。10自來水洗。（后面的切片脫蠟至水一般都是1-10）11.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。12水洗。13抗原修復。.PBS洗3次，1分鐘/次。15加入血清孵育20分鐘。16摔干血清，加入一抗 60分鐘。.PBS洗3次，2分鐘/次。18加入二抗孵育30分鐘。.

2、PBS洗3次，2分鐘/次。20加入ABC復合物，孵育30分鐘。.PBS洗3次，2分鐘/次。.DAB-H2O2孵育切片5-10分鐘。.PBS洗，水洗。.Harris蘇木素染核 5-10分鐘。25水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。匚卜 LSAB 法。（SP 法Labelled streptavidim biotln）1切片脫蠟至水。2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。3水洗。4抗原修復。5.PBSa 3次，1分鐘/次。6加入血清孵育10分鐘。7W去血清，加入一抗孵育30-60分鐘。.PBSa 3次，每次2分鐘。加入二抗，孵育 20分鐘。.PBSa 3次，每次2分鐘。10加入SP復合物

3、孵育20-30分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。.DAB-H2O2 孵育 5-10 分鐘。.PBS洗，水洗。.Harris蘇木素染核 5-10分鐘。水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。匚）真空負壓LSAB法片脫蠟至水。2.0.3%H2O2甲醇真空負壓處理 5min.3水洗。4如果需要，可進行抗原修復。5.PBSc 3次，每次1分鐘。6加入正常血清真空負壓處理5min。7摔干血清，加入第一抗體，真空負壓處理5分鐘。8.PBSa 3次，每次2分鐘。9加入二抗（即連接抗體）真空負壓處理5分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。11加入鏈卵蛋白復合物，真空負壓處理5分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。.DAB

4、-H2O2 孵育 5-10 分鐘。.PBS洗，水洗。15染核，分化，藍化，脫水，透明并封固。注：真空負壓即將真空干燥中抽成真空。負壓達 66.7KPa(500mmHg)但)Envision TM Systems.1切片脫蠟至水。2.0.3%比。2甲醇處理切片10分鐘。3水洗。4抗原修復。.PBSa 3次，每次1分鐘。6加入一抗體孵育30-60分鐘。.PBSa 3次，每次2分鐘。8加入增強劑孵育20-30分鐘。.PBSa 3次，每次2分鐘。10加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育 20-30分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。.DAB-H2O2 孵育 5-10 分鐘。.PBS洗，水洗。.Harris蘇木

5、素染核 5-10分鐘。水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。亞)免疫組化雙染色法。(i ) (lonmuno-Histochemistry double staimimg method)片脫蠟至水。2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。3水洗。4抗原修復。5.PBSc 3次，每次1分鐘。6加入非免疫性動物血清，孵育10分鐘。7.PBSc 3次，每次2分鐘。8加入第一抗體孵育 60分鐘。9.PBSa 3次，每次2分鐘。10加入生物素化的第二抗體，孵育10分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。12加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。14加入DAB-H 2O2孵育5-10

6、分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。16加入雙染增強液，孵育 10分鐘。17加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。19加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。21加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。23加入鏈卵蛋白素堿性磷酸酶孵育10分鐘。24.PBS洗3次，每次2分鐘。25加入AEC溶液，孵育5-10分鐘。26自來水洗。27蘇木素染核5-10分鐘。28水性封片。注：1第一種復合物也可先用鏈卵蛋白素堿性磷酸酶。2第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液，顏色為藍黑色，但應與蘇木素鑒別。代卜 免疫組化的雙染色法 (ii) (I

7、mmuno-histochemistry double staining method)1切片脫蠟至水。2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。3水洗。4抗原修復。5.PBSc 3次，每次1分鐘。6加入選用的第一抗體孵育30-60分鐘。7.PBSc 3次，每次2分鐘。8加入增強劑孵育20-30分鐘。9.PBSa 3次，每次2分鐘。10加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育11.PBS洗3次，每次2分鐘。12加入DAB-H 2O2孵育5-10分鐘13.PBS洗3次，每次2分鐘。14加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。16加入增強劑孵育20-30分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘

8、。18加入酶標抗兔/鼠堿性磷酸酶復合物孵育 20-30分鐘。.PBS洗3次，每次2分鐘。20加入AEC溶液孵育5-10分鐘。21自來水洗。22蘇木素染核5-10分鐘。23水性封片。七）細胞培養(yǎng)片免疫熒光染色法。1將細胞于載片或蓋玻片的片子用生理鹽水洗幾次。.丙酮固定10分鐘。.PBSf洗3次，每次1分鐘。4加入選用的第一抗體孵育120分鐘。.PBSc 3次，每次2分鐘。6加入熒光抗體孵育 60分鐘以上。.PBSt 3次，每次2分鐘。.0.1%尹文氏藍襯染3分鐘。9水洗，蒸儲水洗。10水性膠封片或用緩沖甘油封片。八）真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養(yǎng)片。1將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用生理鹽水浸洗數(shù)次，徹底洗去蛋白液。也丙酮固定5-10分鐘。3.PBS