干熱處理對西瓜種子活力及細菌性果斑病滅菌效果影響的研究

1、 干熱處理對西瓜種子活力及細菌性果斑病滅菌效果影響的研究摘要隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的加深，生產(chǎn)者對種子的質(zhì)量要求越來越高，維權(quán)意識也不斷增強。因此加強種子的安全生產(chǎn)對穩(wěn)定社會經(jīng)濟秩序、保障國民生產(chǎn)尤為重要。廣義的種子處理是指人們在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用藥劑浸種、攔種或是曬種等方法來提高種子的播種品質(zhì)，保證種子發(fā)芽迅速整齊、幼苗生長健壯，防治病蟲害，以此提高農(nóng)作物的產(chǎn)量及增強其品質(zhì)。狹義的種子處理就是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中采用物理、化學(xué)、生物等方法保護種子，防治病蟲害，確保作物生長健壯，從而達到高產(chǎn)、高質(zhì)。本文以含水量為7%左右的西瓜種子為研究材料，研究不同溫度預(yù)緩沖處理對干熱處理過程中種子活力的影響，以及干熱處

2、理對西瓜種子活力和細菌性果斑病滅菌效果的影響。以探索西瓜種子高溫干熱處理前最佳的溫度緩沖組合，及最佳的干熱處理組合。關(guān)鍵詞：干熱處理；西瓜；種子活力；細菌性果斑病目錄 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc482762251 摘要 PAGEREF _Toc482762251 h 1 HYPERLINK l _Toc482762252 一、引言 PAGEREF _Toc482762252 h 3 HYPERLINK l _Toc482762253 二、干熱處理對西瓜細菌性果斑病滅菌效果的影響 PAGEREF _Toc482762253 h 3 HYPERLINK l _

3、Toc482762254 （一）材料與方法 PAGEREF _Toc482762254 h 4 HYPERLINK l _Toc482762255 （二）結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc482762255 h 6 HYPERLINK l _Toc482762256 （三）討論 PAGEREF _Toc482762256 h 10 HYPERLINK l _Toc482762257 三、不同緩沖處理對種子活力的影響 PAGEREF _Toc482762257 h 11 HYPERLINK l _Toc482762258 （一）試驗材料 PAGEREF _Toc482762258 h 11 H

4、YPERLINK l _Toc482762259 （二）試驗方法 PAGEREF _Toc482762259 h 11 HYPERLINK l _Toc482762260 （三）結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc482762260 h 13 HYPERLINK l _Toc482762261 （四）討論 PAGEREF _Toc482762261 h 16 HYPERLINK l _Toc482762262 四、干熱處理對種子活力的影響 PAGEREF _Toc482762262 h 17 HYPERLINK l _Toc482762263 （一）試驗材料 PAGEREF _Toc48276

5、2263 h 17 HYPERLINK l _Toc482762264 （二）試驗方法 PAGEREF _Toc482762264 h 17 HYPERLINK l _Toc482762265 （三）結(jié)果與分析 PAGEREF _Toc482762265 h 20 HYPERLINK l _Toc482762266 （四）小結(jié) PAGEREF _Toc482762266 h 25 HYPERLINK l _Toc482762267 五、結(jié)論 PAGEREF _Toc482762267 h 25 HYPERLINK l _Toc482762268 參考文獻 PAGEREF _Toc4827622

6、68 h 27 HYPERLINK l _Toc482762269 致謝 PAGEREF _Toc482762269 h 29一、引言全世界西瓜的種植面積很大，西瓜病害一直是嚴重影響西瓜生產(chǎn)的重要因素之一，細菌性果斑病作為典型的種傳性病害，從種子這個源頭上去防治病害的發(fā)生、傳播對西瓜安全生產(chǎn)尤其關(guān)鍵。干熱滅菌是目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用于種子生產(chǎn)加工的一種經(jīng)濟有效的方法，對殺死各種病原菌都有效。并且它不需經(jīng)液體浸泡種子或藥劑拌種，避免了藥劑殘留及毒性的問題，而且對種子生產(chǎn)加工來說節(jié)省了工序、成本。干熱處理研究主要分干熱處理對病原菌的滅菌效果和干熱處理對種子活力的影響兩部分，現(xiàn)有文獻針對西瓜細菌性果斑病的有

7、效干熱處理的溫度、時間組合研究較少，干熱處理過程中種子活力變化的研究大多局限在簡單的發(fā)芽趨勢，而種子在不同溫度、時間干熱處理過程中，種子內(nèi)部生理活性及耐貯藏性的變化研究鮮有報道。并且在對種子抗逆性的研究中發(fā)現(xiàn)，在對種子進行高溫處理前，對種子進行一定溫度的緩沖能讓種子較好地適應(yīng)高溫，而緩沖方式也有待進一步探索。因此本文旨在對以下三種進行研究和完善:（1）干熱處理對種子內(nèi)在生理及耐貯藏性的影響。（2）干熱處理前不同緩沖預(yù)處理對種子活力的影響。（3）不同干熱處理對細菌性果斑病的滅菌效果。由此探索干熱處理與種子活力及滅菌效果的關(guān)系，從而對實際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。二、干熱處理對西瓜細菌性果斑病滅菌效果

8、的影響西瓜細菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch of watermelon，簡稱BFB)，它的病原菌屬燕麥噬酸菌西瓜亞種(Acidovorax avenge subsp .citrulli，Aac)，是葫蘆科植物上的一種嚴重的種傳性檢疫性病害，該病潛伏期長，傳染力大，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重損失，在生產(chǎn)中該病一旦爆發(fā)后藥劑防治效果較差，目前還沒有能徹底殺滅該細菌且不影響種子或植株生長的特效藥劑。因此，從種子這個源頭上去控制瓜類細菌性果斑的傳播與發(fā)生顯得尤其重要，干熱滅菌是目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用于種子生產(chǎn)加工的一種經(jīng)濟有效的方法，對殺死各種病原菌都有效，它不需經(jīng)液體浸泡種子或藥劑拌種，避

9、免了藥劑殘留及毒性的問題，并且對種子活力的影響也較小，是目前較為推崇的一種種子處理方法。本試驗針對干熱處理對西瓜細菌性果斑病滅菌效果的影響進行研究，探索出有效的干熱滅菌方法，從而對實際生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。（一）材料與方法1、試驗材料本文研究中的西瓜種子為黑媚娘、紅大(湖南省瓜類研究所提供)，供試菌株由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植保學(xué)院提供。2、試驗試劑TaqDNA聚合酶、電泳緩沖液、dNTP, D2000 DNA Maker、DNA上下游引物，溟酚藍、buffeTris, EDTA, NaCI, NH4P04, KCI, MgS047H20,酵母提取物、硼酸、瓊脂、溴甲酚(bromcresol、亮藍R(

10、brilliant R)、乙醇、放線菌酮(Cycloheximide) ,硫代巴比妥酸(TBA、三氯乙酸、氫氧化鈉。西瓜細菌性果斑病試劑盒。3、試驗儀器電子天平(島津ALTY220)凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel Logic 212 PRO)PCR擴增儀(BIO-RAD C1000TM Thermal Cycler )紫外分光光度計(YK75290176)光照培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福PRX-450L)冰箱(ZANUSSI)超凈工作臺(SW-CJ-2D)干燥箱(上海培因DHG-9070A)高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30FBS )SelectPette移液器電泳儀4、試驗方法（1）制備帶菌種子將繼代活化

11、的細菌性果斑病菌在LB平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)基，在33恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d-4d，將平板上的菌落用無菌水洗下，并稀釋成濃度約108CFU/ml的菌懸液，即波長為600nm下吸光度為0.4左右的細菌個數(shù)。將西瓜種子按1克種子:4m1菌懸液的比例浸泡，振蕩2h (28, 180rmp)，再35烘干備用。（2）干熱處理先將己接細菌性果斑病菌的種子烘干至7%左右的含水量，由于前期預(yù)備試驗得出T2: 5012h為最好的預(yù)溫緩沖處理，為保證干熱滅菌條件的一致性，本章的滅菌效果試驗均沿用T2: 5012h溫度預(yù)緩沖。種子在儀器內(nèi)進行預(yù)溫緩沖處理后直接調(diào)至各溫度、時間干熱處理，對照為不進行干熱處理的帶

12、菌種子。各干熱處理如下:處理完后將種子置于干凈的自封袋內(nèi)密封，對其進行各項檢測。5、干熱處理滅菌效果的測定（1）EBB培養(yǎng)基配制:準確稱取硼酸0.25g、酵母提取物0.3g,瓊脂16g, NH4PO41g、MgSO47H2O0.2g, KCl0.2g、將PH值調(diào)至5.4左右，加入600L 15mg/ml澳甲酚、1 ml 10mg/ml亮藍R，滅菌后冷至55，加10ml乙醇、2ml 250mg/ml放線菌酮，再倒入滅菌的培養(yǎng)皿中。每處理隨機取100粒待測西瓜種子，放入100mI錐形瓶中，加入50mI無菌水充分浸泡，26, 160rmp振蕩2h后，吸取1 ml菌懸液依次稀釋102倍。再從102倍的

13、稀釋液中取100L在直徑為9cm的EBB平板培養(yǎng)基上涂板，每處理5皿，以未進行干熱處理的帶菌種子為對照。在33的恒溫箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)4d，記錄菌落數(shù)。（2）育苗基質(zhì)用160滅菌4h后，裝后50孔的育苗盤中備用。將待檢測的西瓜種子播入育苗盤中，每孔1粒，每處理播100粒，設(shè)三次重復(fù)，未進行干熱處理的帶菌種子作為對照，置于28保濕盒內(nèi)培養(yǎng)。等子葉展開后，觀察葉片上有無油浸狀或水浸狀病斑出現(xiàn)，統(tǒng)計發(fā)病株數(shù)。（3）PCR檢測此方法主要是在育苗檢測及選擇性培養(yǎng)基檢測的基礎(chǔ)之上，對疑似細菌性果病病斑癥狀的病葉及特征性菌落作進一步鑒定。引物序列：上游引物WFB 1: 5-GACCAGCCACACTGGGAC-3

14、下游引物WFB2: (5-CTGCCGTACTCCAGCGAT-3 ),用本引物PCR擴增產(chǎn)生360bp特異性條帶。西瓜病葉總DNA使用CTAB法提取。檢測菌落時，直接用移液槍沾取用少量無菌水稀釋，稀釋液即為模板。擴增體系：10*PCR緩沖液5.0l2.5mM dNTP2l10mM上下游引物各1lTaqDNA聚合酶1.0lDNA模板4.0l無菌超純水11l總體積為25l擴增條件為:95預(yù)變性5min;95變性40s，65退火lmin, 72延伸40s，循環(huán)35次;72延伸5min; 12保存。（4）雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)從待檢西瓜種子中取50粒用20m1磷酸緩沖26、160rmp振

15、蕩2h后，取浸泡液2000r/min離心l0min，取上清液作為待檢樣品稀釋液。其余操作步驟參照BFB檢測試劑盒說明書。6、試驗數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)分析與軟件使用SPSS分析軟件，Excel WPS軟件。（二）結(jié)果與分析1、種子浸提液選擇性培養(yǎng)基檢測表2-1干熱處理對細菌性果斑病的滅菌效果由表2-1顯示兩個供試品種黑媚娘與紅大種子浸泡液經(jīng)稀釋103倍后，經(jīng)EBB選擇培養(yǎng)培養(yǎng)后，各干熱處理對種帶果斑病的滅菌效果明顯。隨著干熱處理溫度的升高及處理時間的延長，滅菌率增長明顯。70干熱處理條件下，各處理時間的滅菌率之間均有顯著性差異，7024h干熱處理條件下，媚娘與紅大的滅菌率分別達為53.2%和31.4

16、%，而隨著處理時間延長到72h干熱處理條件下，黑媚娘與紅大的滅菌率分別達到了90.6%和89.5%，說明此溫度條件下，延長滅菌時間對提高滅菌率效果非常明顯。80干熱處理條件下，隨處理時間的延長，滅菌率變化不明顯，8024h干熱處理條件下，黑媚娘和紅大的滅菌率分別為93.7%和93.1%，8072h干熱處理條件下，滅菌率分別為100.0%和99.9%，因此在使用80干熱處理時，延長處理時間對提高滅菌率效果不明顯，反而會大大降低了種子的活力。綜合上表，7072h、7572h和80處理是適宜選擇的干熱滅菌處理組合，兩試驗品種滅菌率均達到了89.5%以上。圖2-1細菌性果斑病在EBB培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)

17、2、育苗檢測表2-2是將各類試驗種子放入溫室中，統(tǒng)計發(fā)病率結(jié)果。未經(jīng)干熱處理的帶菌種子的發(fā)病率較高，兩品種分別為33.0%和33.3%，隨著處理溫度的升高及處理時間的延長，種苗發(fā)病率呈下降趨勢，并且各干熱處理之間差異明顯。7572h, 8048h, 8072h處理發(fā)病率最低，黑媚娘分別為8.7%, 4.0%和1.0%，紅大分別為11.3% , 8.7%和5.7%，與對照均有極顯著性差異，說明干熱處理對細菌性果斑病防治效果較好。表2-2干熱處理對細菌性果斑病的滅菌效果圖2-2發(fā)病西瓜苗圖2-3發(fā)病組織中提取的疑似感病植株葉片PCR鑒定結(jié)果3、酶聯(lián)免疫試劑盒檢測表2-3酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果顯示，隨著處

18、理溫度的升高及處理時間的延長，酶聯(lián)免疫檢測結(jié)果呈現(xiàn)逐漸由陽性轉(zhuǎn)陰性。其中7572h, 8072h處理的酶聯(lián)免疫結(jié)果均為陰性，其它處理結(jié)果三重復(fù)中有兩個陽性以上，7024h處理全為陽性。說明干熱處理對果斑病滅菌效果顯著。表2-3干熱處理對細菌性果斑病的滅菌效果（三）討論帶菌種子浸提液半選擇性培養(yǎng)基檢測結(jié)果表明，不同組合干熱處理對種子表面帶菌的滅菌效果非常明顯。7024h對黑媚娘、紅大的滅菌率分別為53.2%, 31.4%，而8072h處理對種子的滅菌率分別高達100%, 99.9%。說明，干熱處理的滅菌效果明顯隨著處理溫度的升高及處理時間的延長而增加。育苗檢測結(jié)果顯示，西瓜種子經(jīng)各干熱處理后，發(fā)

19、病率與對照相比基本都有極顯著性差異。并且各干熱處理組合之間發(fā)病率差異也顯著。因此各干熱處理對抵制果斑病的發(fā)病情況有較顯著的效果。酶聯(lián)免疫試劑盒檢測效果與半選擇性培養(yǎng)基的檢測結(jié)果具有較好的驗證效果。在7572h, 8072h處理時，黑媚娘菌落數(shù)為最低，分別為1.7, 0.0個，而酶聯(lián)免疫結(jié)果均為陰性，紅大分別為4.7, 0.3,酶聯(lián)免疫結(jié)果也均為陰性。因此7572h, 8072h處理對細菌性果斑病有非常好的防治效果。三、不同緩沖處理對種子活力的影響在針對較耐高溫的細菌性果斑病進行滅菌處理時，試驗中所設(shè)置的干熱處理溫度也較高。從生物體對外界環(huán)境適應(yīng)的特征分析，在對種子進行高溫干熱處理前，預(yù)先對種子

20、進行階梯溫度緩沖，理論上有利于增強種子對高溫逆境的適應(yīng)性，從而減少高溫環(huán)境對種子活力的損傷。因此本試驗以西瓜種子黑媚娘為材料，探究不同溫度預(yù)緩沖條件對種子活力的影響，以篩選出適宜于西瓜種子干熱處理的最佳緩沖條件。（一）試驗材料1、試驗種子試驗西瓜品種為黑媚娘。2、試驗試劑培養(yǎng)皿、鑷子、硫酸銅、硫代巴比妥酸(TBA)、三氯乙酸、氫氧化鈉、磷酸緩沖液、研缽、石英砂、油標卡尺、發(fā)芽紙，過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶試劑盒。3、試驗儀器高速臺式離心機(eppendorf 5415R )電子天平島津AUY220 )酶標儀(DNM-9602A )紫外分光光度計(YK75290176)光照培養(yǎng)箱(寧

21、波海曙賽福PRX-450L )冰箱(ZANLTSSI )干燥箱(上海培因DHG-9070A )高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30FBS )恒溫水浴鍋（二）試驗方法1、種子緩沖處理種子高溫千熱滅菌處理前溫度預(yù)緩沖處理分三種:T1: 500h(對照組)，T2：5012h, T3: 5024h。此緩沖處理的作用主要是及讓種子在進行高溫干熱處理前經(jīng)歷階梯溫度緩沖，以增強種子的適應(yīng)能力。2、干熱處理種子進行預(yù)溫緩沖處理后直接將烘箱溫度調(diào)到干熱滅菌處理設(shè)定溫度，進行以下處理，種子原始含水量為7%左右，直接將其放入烘箱內(nèi)進行不同溫度、時間干熱組合處理，CK為不進行干熱處理的種子。各干熱處理組合A1-A9如下

22、:處理完后將種子在20室溫條件下置于飽合CaCl2溶液(RH=35%)的容器中回濕24h，再置于裝有飽合NH4Cl (RH=70%)的密閉容器中回濕24h，最后置于裝有水的密閉容器中回濕24h(RH=100% )，再對其進行各項指標測。3、試驗數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)分析與軟件使用SPSS分析軟件，Exce12003軟件。4、干熱處理后種子活力檢測指標（1）發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)處理后的種子均在15d內(nèi)進行發(fā)芽試驗。隨機選取形態(tài)飽滿、發(fā)育良好的種子100粒，設(shè)4個重復(fù)，用1%硫酸銅消毒5分鐘。將種子均勻平鋪在墊有1層發(fā)芽紙的毛巾中，毛巾事先充分濕潤擰到合適的濕度，蓋上一層濕潤的發(fā)芽紙后合上毛巾，放置

23、在30恒溫箱中，每天計錄發(fā)芽數(shù)，直到第14d為止。計算:Dt發(fā)芽日數(shù)，Gt與Dt相對應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)與發(fā)芽日數(shù)。（2）種子抗老化特性的測定將西瓜種子置于溫度45、相對濕度(RH)100%的條件下老化3d，得到老化后的西瓜種子。具體做法參照鄭曉鷹:在玻璃干燥器底部盛入3cm深的水，中層的白磁板用塑料網(wǎng)格替代，在網(wǎng)格上鋪一層紗布，種子平攤于紗布上，然后蓋上干燥器蓋子。將干燥器置于45恒溫箱中進行高溫高濕老化處理，3d后取出種子對其進行活力測定。（三）結(jié)果與分析1、干熱處理對種子發(fā)芽特性的影響圖3-1不同緩沖處理對種子發(fā)芽率的影響由圖3-1可得，三種緩沖在70處理與7524h處理時，它的趨勢線基本

24、重合，并且各處理之間與對照無顯著性差異，說明在這幾種干熱處理條件下，幾種緩沖對種子發(fā)芽率影響不大。7548h時T2緩沖處理發(fā)芽率為96.1%，比T1, T3分別高6.8%,1.9%，8024h處理時，T2比T1高5.5%，相對其它各干熱處理條件，這兩個干熱處理組合下，不同溫度預(yù)緩沖對種子的發(fā)芽特性的影響差別相對較大，但也未達到顯著性差異。圖3-2不同緩沖處理對種子發(fā)芽勢的影響由圖3-2可知，三種不同緩沖處理對干熱處理后西瓜種子的發(fā)芽勢影響不同，T2緩沖處理總體發(fā)芽勢最高，其次為T3, T1。70處理、75處理及8024h條件下T2與T3兩種緩沖對其影響不大，與對照無顯著性差異。8048h處理條

25、件下T2比T1、T3分別高20.8%, 13.6%，并且T2與對照無顯著性差異，T1, T3與對照有顯著性差異。8072h干熱處理條件下，T2比T1、T3分別高14.1%, 12.5%，T2與對照無顯著性差異，T1, T3與對照有顯著性差異。圖3-3不同緩沖處理對種子發(fā)芽指數(shù)的影響由圖3-3可以看出，干熱處理在一定程度上能促進種子的萌發(fā)速度，T2處理組的發(fā)芽指數(shù)均高于CK組，T1處理的發(fā)芽指數(shù)最低。T2緩沖時間比T1長，不僅使種子在進入高溫干熱處理前有個足夠的溫度適應(yīng)過程，還能讓種子自由水含量處于合理超干水平，這有助于增強植物個體的抗逆境能力。而T3處理比T2溫度緩沖時間更長，而這一緩沖處理條

26、件下，種子的發(fā)芽指數(shù)相較T2有所降低，這可能是由于50緩沖時間過長，對種子產(chǎn)生了不良影響。2、干熱處理對種子抗老化特性的影響高溫高濕人工老化種子的方法，老化中控制的條件比較接近于自然條件，其老化機理與自然老化機理相似，兩者之間的差別在于劣變速度不同。種子人工老化能預(yù)測種子耐貯藏性的這一特征，在多種類型的種子上也得到了試驗證明。圖3-4不同緩沖對種子抗老化性的影響圖3-5不同緩沖對種子抗老化性的影響圖3-6不同緩沖對種子抗老化性的影響由圖3-4,圖3-5和圖3-6可知，三種緩沖處理對種子發(fā)芽特性的差異較大，其中T2種子發(fā)芽特性最好，其次T3, T1。7024h, 7048h處理，各緩沖對其影響差

27、異不大，并且發(fā)芽率與對照無顯著性差異。隨著處理溫度的升高及處理時間的延長，各緩沖處理之間的差異呈增長趨勢。7072h處理條件下，發(fā)芽勢T2比T3高16.9%，T2比T1高28.9%，發(fā)芽指數(shù)T2比T3高5.5 , T2比T1高11.32。75 48h與72h時，發(fā)芽勢T2比TI, T3分別高39.8%, 37.4%。（四）討論1、不同預(yù)緩沖處理對種子干熱處理后發(fā)芽特性的影響三種不同緩沖T2最有利于保持種子活力。不同緩沖處理對種子發(fā)芽率的影響主要體現(xiàn)在80高溫處理時，8024h處理時，T2比T1發(fā)芽率高5.5%，T3比T1高5.2%。三種緩沖對種子發(fā)芽勢的影響比較明顯，各個干熱處理條件下，T2與

28、T3都明顯好于T1處理。而T2與T3之間在70, 75及8024h處理時，發(fā)芽勢基本持平，說明在此干熱處理條件下，T2, T3緩沖對其種子發(fā)芽勢的影響無區(qū)別。8048h, 72h處理時，不同緩沖處理對其發(fā)芽勢的影響都比較大。種子發(fā)芽指數(shù)結(jié)果顯示，75, 80條件下，T2與T3緩沖處理對種子的發(fā)芽指數(shù)影響區(qū)別較大，T2發(fā)芽指數(shù)明顯高于T3。2、不同預(yù)緩沖處理對種子干熱處理后抗老化特性的影響用種子人工老化來預(yù)測種子的耐貯藏性是被廣泛應(yīng)用的研究方法。從老化后的種子發(fā)芽狀況來看，三種不同緩沖對其各個溫度的干熱處理活力影響區(qū)別都很大，方差分析結(jié)果顯示不同緩沖對其種子老化后的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)均有極

29、顯著性差異。T2緩沖處理后的種發(fā)芽狀況最好，依次為T3, T1。但是不管何種緩沖處理的種子，老化后對其發(fā)芽狀況的影響都很大，與對照差異明顯，說明干熱處理后的種子耐貯藏性受到了嚴重影響。四、干熱處理對種子活力的影響第二章的試驗結(jié)果證明，試驗所設(shè)置的干熱處理條件對種帶細菌性果斑病有明顯的滅菌效果，第三章的試驗結(jié)果在前人的基礎(chǔ)上探索出適宜于種子干熱處理的溫度緩沖條件。為了使干熱處理安全、有效地應(yīng)用于實踐生產(chǎn)，并且全面掌握干熱處理條件與種子活力的關(guān)系，本試驗對不同溫度、時間干熱處理過程中，種子內(nèi)部生理活性及耐貯藏性的變化進行探索。（一）試驗材料1、試驗種子試驗西瓜品種為黑媚娘。2、試驗試劑培養(yǎng)皿、鑷子

30、、硫酸銅、硫代巴比妥酸(TBA、三氯乙酸、氫氧化鈉、磷酸緩沖液、研缽、石英砂、油標卡尺、發(fā)芽紙，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD),過氧化氫酶(CAT)試劑盒。3、試驗儀器高速臺式離心機(eppendorf 5415R)電子天平(島津AUY220 )酶標儀(DNM-9602A )紫外分光光度計(YK75290176 )光照培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福PRX-450L )冰箱(ZANUSSI )干燥箱(上海培因DHG-9070A )高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30FBS )恒溫水浴鍋（二）試驗方法1、種子緩沖處理由前期試驗得出T2: 50處理12h為最好的預(yù)緩沖處理，因此本章對比高溫干熱處

31、理對種子活力影響的試驗均采用T2: 50處理12h溫度預(yù)緩沖。2、干熱處理種子進行預(yù)備處理后處理后直接將烘箱溫度調(diào)到各高溫干熱滅菌處理設(shè)定溫度，進行以下處理，不處理的種子本身含水量為7%左右，直接將其放入烘箱內(nèi)進行不同溫度、時間干熱處理組合，CK為不經(jīng)過干熱處理的種子。各干熱處理組合A1-A9如下:處理完后將種子置于干凈的自封袋內(nèi)密封，對其進行各項指標測定。3、試驗數(shù)據(jù)分析軟件數(shù)據(jù)分析與軟件使用SPSS分析軟件，Exce12003軟件。4、干熱處理后種子活力檢測指標（1）發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)方法參考第二章。（2）種子抗老化特性的測定方法參考第二章。（3）電導(dǎo)率的測定選取大小一致剝殼了并且無

32、機械損傷的種子40粒，取50ml玻璃容量，用去離子水清洗干凈，侄置涼干。將種子放入玻璃容器中，加入20ml去離子水，測定浸泡初始值A(chǔ)1。容器口用薄膜蓋好，以防灰塵污染和減少蒸發(fā)。再將容器置于28下放置2h,6h, 8h, 12h，分別用電導(dǎo)儀測定其不同時間段的電導(dǎo)率A2，各時間段測定完后，將容器置于100水浴30min，冷卻至室溫后測定A3。測定時將容器中溶液稍微振蕩，并且手放置于容器口，以免影響測定值。（4）MDA丙二醛采用硫代巴比妥酸法進行丙二醛的測定。取0.6g種仁加10ml 5%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨成勻漿，8000r、4條件下離心10min，取上清液4m1加0.67%硫代

33、巴比妥酸(TBA) 4ml混合后100水浴15min冷卻，再6000r離心1 0min，對照加4ml三氯乙酸代替上清液，取上清夜分別在532nm, 600nm和450nm下測定吸光值。MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm有最大吸收峰值，TBA可溶性糖反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收峰值在450nm。計算MDA的濃度:（5）SOD超氧化物歧化酶采用氮蘭四(NBT)法測定SOD活性。稱取0.6g剝了殼的西瓜種仁，按重量(g):(ml) =1: 9的比例，加入9倍體積的磷酸緩沖液(0.1ml/L PH7.4)及少量石英砂冰浴研磨成勻漿，再5000r/min離心l0min，取上清液再次離心，再稀釋成合適的濃度進行實驗

34、，實驗方法參照試劑盒說明書操作。37反應(yīng)20分鐘后，取反應(yīng)液在450nm處讀數(shù)。計算公式：（6）POD過氧化物酶采用愈創(chuàng)木酚法進行測定。稱取0.6g剝了殼的西瓜種仁，按重量(g): (ml) =1:9的比例，加入9倍體積的磷酸緩沖液(0.1 ml/L PH7.4 )及少量石英砂冰浴研磨成勻漿，再5000r/min，離心l0min，取100L上清，按試劑盒說明書操作表進行操作，37水浴反應(yīng)30min，反應(yīng)完成后，混勻再離心，取上清液于470nm處，測定OD值。計算公式：（7）CAT過氧化氫酶采用鑰酸按法進行測定。稱取0.6g剝了殼的西瓜種仁，按重量(g): (ml)=1:9的比例，加入9倍體積的

35、磷酸緩沖液(0.1 ml/L PH7.4 )及少量石英砂冰浴研磨成勻漿，再5000r/min，離心l0min，取上清液再次離心，試驗操作完成后取反應(yīng)液于405nm處，雙蒸水調(diào)零，測定各管吸光度。計算公式：（三）結(jié)果與分析1、干熱處理對種子當下發(fā)芽特性的影響表4-1為種子干熱處理后15天內(nèi)進行的發(fā)芽試驗結(jié)果。由上圖可知各干熱處理對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)與對照相比無顯著性差異，說明本試驗的干熱處理溫度、時間對種子當下的發(fā)芽特性并無影響。這可能由于種子在萌發(fā)過程中具有極強的自我修復(fù)能力，并且種子隨時間劣變的程度并不深，因此當下對其進行發(fā)芽試驗后，種子并未表現(xiàn)出明顯的活力受損跡象。表4-1干熱

36、處理對種子發(fā)芽的影響2、干熱處理對種子抗老化特性的影響高溫高濕人工老化種子的方法，老化中控制的條件比較接近于自然條件，其老化機理與自然老化機理相似，兩者之間的差別在于劣變速度不同。種子人工老化能預(yù)測種子耐貯藏性的這一特征，在多種類型的種子上也得到了試驗證明。表4-2結(jié)果表明，隨著干熱處理溫度的升高及處理時間的延長，西瓜種子種子人工老化后的各項發(fā)芽指標明顯呈下降趨勢，80處理下降速度最快。7548h, 72h和80處理的發(fā)芽率與對照有顯著性差異，并且8048h, 72h處理與對照91.0%相比發(fā)芽率分別下降19.4%, 28.5%，達極顯著性差異。7572h和8048h, 72h處理的發(fā)芽勢與對

37、照87.3%相比分別下降22%, 26.2%和33.5%，達極顯著性差異。各干熱處理發(fā)芽指數(shù)下降幅度非常明顯，除7048h, 7072h外與對照均達極顯著性差異。7572h與8072h處理分別比對照發(fā)芽指數(shù)降低14.5(34.4%) , 19.9(47.6%)。70和80不同處理時間之間發(fā)芽特性無顯著性差異，8072h處理與24h和48h處理間有極顯著性差異，說明當80干熱處理時間延長到72h時，對種子活力的損傷非常大。表4-2干熱處理后的種子老化3d后對種子發(fā)芽特性的影響3、干熱處理對種子浸出液電導(dǎo)率的影響圖4-1干熱處理對種子浸出液電導(dǎo)率的影響圖4-2干熱處理對種子浸出液電導(dǎo)率的影響種子受

38、到高溫逆境傷害時，細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到破壞，膜透性增加，從而會向溶液中滲透出較多的電解質(zhì)。因此，通過測定種子浸出液的相對電導(dǎo)率，能反應(yīng)出種子活力的高低，并且，電導(dǎo)率與種子活力負相關(guān)。圖4-1, 4-2結(jié)果表明，隨著干熱處理溫度的的升高及處理時間的延長，種子浸出液相對電導(dǎo)率呈升高的趨勢。8072h處理的的相對電導(dǎo)率明顯高于其它各處理，說明膜受到的損傷最大。接著電導(dǎo)率較高的為7048h, 7072h, 7572h, 8048h，這四個處理相對電導(dǎo)率相差不大，后三個處理趨勢線幾乎重合。7024h, 7524h及對照趨勢線在最底層，相對電導(dǎo)率最低，并且隨著浸泡的延長，相對電導(dǎo)率緩慢上升，坡度較小，說

39、明其膜的完整性保持得較好。種子浸泡2h, 4h和6h時，除8072h外，其它各處理之間的電導(dǎo)率相差很小，隨著浸泡時間的延長，各處理之間的相對電導(dǎo)率值相差越來越大，并且處理溫度越高、處理時間越長的組合，趨勢線坡度越陡，說明種子浸出液中細胞的內(nèi)含物質(zhì)外滲量增加，種子內(nèi)部細胞膜損傷越厲害。4、干熱處理對種子超氧化物歧化酶(SOD)的影響圖4-3表明，西瓜種子在70, 75溫度干熱處理時，隨著處理時間的延長，SOD酶呈增長趨勢，并且各處理組合酶活性均高于對照，7072h與7524h, 48h, 72h處理的的酶活性與對照1225.5U/ml相比，分別升高26.2%. 20.8%, 22.0%和39.3

40、%均達顯著性差異。8048h處理比24h處理SOD酶活性增長18.7%，有顯著性差異。8048h處理與72h處理SOD酶活性趨于平衡，分別為1480.9U/mgprot和1437.1U/mgprot，與對照相比分別上升20.8%和17.3%，并且與對照達顯著性差異。圖4-3干熱處理對種子SOD酶的影響西瓜種子由于高溫的影響，脂質(zhì)過氧化作用逐漸增強，種子內(nèi)部生理機能為抵抗高溫對種子的傷害，通過提高自身的SOD酶活性來催化超氧物陰離子自由基發(fā)生的歧化反應(yīng)，生成H2O2和O2，從而消除O2-，降低對種子的傷害。因此在70, 75和80處理時，隨著處理時間的延長，SOD酶活性都呈現(xiàn)了上升的趨勢。這與娜

41、荷雅的結(jié)論一致。5、干熱處理對種子過氧化物酶(POD)活性的影響圖4-4干熱處理對種子POD酶的影響由4-4圖可知，隨著干熱處理溫度的升高和干熱處理時間的延長，POD酶活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的過程，70和75各處理組合間，酶活性基本維持在一個比較平衡的水平，與對照806.7U/mgprot無顯著性差異，8024h, 48h處理POD酶含量較高，分別為922.2U/mgprot, 917.8U/mgprot，與對照相比分別上升了14.3%. 13.8%。當80處理時間延長到72h時，POD酶活性突然下降到 602.2 U/mgprot，與8048h處理相比，下降了34.4%，并且兩者之間有極顯

42、著性差異。西瓜種子內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化作用隨著處理溫度的升和處理時間的延長而逐漸增強，種子內(nèi)部生理機能通過提高自身的POD酶活性來清除H2O2，降低對種子的傷害。隨著處理時間的延長，使得種子內(nèi)活性氧產(chǎn)生和消除的平衡被破壞，有害物質(zhì)積累。導(dǎo)致POD抗氧化酶活性減弱含量降低，因此在8072h時，POD酶活性突然下降。6、干熱處理對種子過氧化氫酶(CAT)活性的影響CAT是過氧化物酶體的標志酶，它可促使H2O2分解為O2和H2O，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。由圖4-5可知，70,75干熱處理隨著處理時間的延長，CAT酶含量總體呈上升趨勢，80干熱處理

43、，CAT酶活性隨著處理時間的延長先上升后下降。7048h與72hCAT酶含量基本一致，并且與7024h處理有顯著性差異。75各處理時間之間無顯著性差異，8024h, 48h和72h處理之間CAT酶活性有顯著性差異，依次為2428.5mgprot/ml,3185.7mgprot/ml和2834.4mgprot/ml，CAT酶活性先升高后降低，可能是由于種子受到逆境傷害時，種子內(nèi)部生理機能通過提高自身的CAT酶活性來清除H2O2等物質(zhì)，隨著逆境傷害的持續(xù)加深，使得種子內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除平衡被破壞，有害物質(zhì)積累。導(dǎo)致CAT抗氧化酶活性減弱含量降低，因此在8072h時，CAT酶活性突然下降。圖4-5

44、干熱處理對種子CAT酶的影響7、干熱處理對種子丙二醛(MDA)含量的影響種子在遭受高溫逆境傷害時，細胞的脂質(zhì)氧化程度加深，膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量增加，因此可通過種子內(nèi)丙二醛的含量來指示種子內(nèi)膜脂過氧化程度。MDA能強烈地與細胞內(nèi)各種成分發(fā)生反應(yīng)，從而引起對酶和膜的嚴重損傷，最終導(dǎo)致了膜的結(jié)構(gòu)及生理完整性的破壞。圖4-6干熱處理對種子MDA的影響隨著干熱處理溫度的升高及處理時間的延長，MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢，對照MDA含量最低。7072h與24h, 48h有顯著性差異，分別比24h, 48h高38.3%, 31.7%。75和80處理對種子內(nèi)部MDA含量與對照均有顯著性差異。75各處理

45、之間無顯著性差異，依次分別為0.147umol/L, 0.151umol/L和0.155umol/L。80各處理對種子MDA含量的影響差異較大，72h分別比24h, 48h處理高 35.8%, 17.0%，說明在此溫度條件下，處理時間對種子活力的影響的差異非常明顯。48h條件下，70, 75和80處理的MDA含量分別為0.126umol/L, 0.151umol/L和0.188umol/L, 70, 75之間無顯著性差異，70, 75與80處理之間有顯著性差異，說明相較其它兩溫度處理，80處理對種子的損傷的非常大。（四）小結(jié)種子酶活性的這一變化與種子當下及老化后的發(fā)芽特性規(guī)律有所不同。各干熱處

46、理組合種子當下的發(fā)芽狀況與對照相比均無顯著性差異，這可能由于種子在萌發(fā)過程中具有極強的自我修復(fù)能力，并且種子隨時間劣變的程度并不深，因此在對其進行發(fā)芽試驗后，種子并未表現(xiàn)出明顯的活力受損跡象。而種子老化后的萌發(fā)狀況，隨著處理溫度的升高及處理時間的延長呈現(xiàn)明顯下降趨勢，這由于老化過程將種子自身微小的生理機能缺陷累積放大，因此老化后各千熱處理組合能呈現(xiàn)明顯的差異性。五、結(jié)論1、干熱處理對種帶細菌性果斑病滅菌效果的影響干熱處理對種子表面帶菌的滅菌效果非常明顯。隨著處理溫度的升高及處理時間的延長，滅菌效果明顯增強，酶聯(lián)免疫結(jié)果逐漸由陽轉(zhuǎn)陰，細菌性果斑病的發(fā)病率也呈明顯降低的趨勢，黑媚娘西瓜種子在707

47、2h、7072h和8072h處理對種子表面的滅菌率分別高達90.6%, 99.4%和100%。2、不同緩沖處理對西瓜種子發(fā)芽特性和抗老化能力的影響以含水量為7%左右的黑媚娘西瓜種子為試驗材料，探索種子干熱處理前最佳的緩沖處理條件。結(jié)果表明:5012h緩沖處理的種子發(fā)芽特性及抗老化能力比5024h和500h明顯要好，說明5012h是適宜用于種子干熱處理前最佳的溫度緩沖處理組合。3、干熱處理對西瓜種子活力的影響70、75干熱處理條件下，隨著處理時間的延長，抗氧化酶活性、MDA含量及種子浸出液相對電導(dǎo)率呈逐漸上升的趨勢。80在各處理時間條件下CAT, POD活性分別呈現(xiàn)先上升后下降、緩慢下降的趨勢，

48、可能80干熱處理時，高溫脅迫程度深，種子首先能通過提高自身抗氧化酶來清除氧化物質(zhì)的傷害，而隨著處理時間的延長，逆境肋、迫程度的進一步增加，并且抗氧化酶系統(tǒng)長期處于消耗狀態(tài)，因此其活性又逐漸降低。70, 75和80干熱處理后的種子內(nèi)在生理的一系列變化并未影響到種子的發(fā)芽特性，在同一時期(種子干熱處理后15天內(nèi))對種子進行的發(fā)芽試驗表明，各干熱處理組合對種子發(fā)芽特性均無影響，與對照相比均無顯著性差異，可能由于種子在萌發(fā)過程中有較強的自我修復(fù)能力，因此，種子的發(fā)芽特性并未呈現(xiàn)出差異性。而干熱處理后種子的抗老化試驗結(jié)果表明，隨著干熱處理溫度的升高及處理時間的延長，種子老化后的萌發(fā)活力隨之也降低，70各

49、時間處理及7524h處理降低幅度較小，與對照相比發(fā)芽率、發(fā)芽勢均無顯著性差異，80各時間處理及75 48h. 72h處理的種子萌發(fā)活力受到嚴重影響，與對照均有顯著性差異。說明干熱處理影響了種子的耐.貯藏性，因此不宜久放，需當年種植。因此綜合分析干熱處理對種子活力及滅菌效果的影響，7072h處理是適宜于西瓜種子細菌性果斑病干熱滅菌處理的最佳組合。本試驗結(jié)果為干熱處理廣泛應(yīng)用于實踐提供了理論依據(jù)。參考文獻1 牛慶偉,孔秋生,黃遠,別之龍. 不同藥劑處理對西瓜細菌性果斑病帶菌種子的影響J. 長江蔬菜. 2012(22) 2 宋順華,吳萍,鄭曉鷹,丁海鳳. 干熱處理對蔬菜種子質(zhì)量的影響及其殺菌效果研究

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