加味四君子湯對小鼠腸道免疫功能調(diào)整作用的研究

1、加味四君子湯對小鼠腸道免疫功能調(diào)整作用的研究【摘要】目的觀察加味四君子湯和思密達對小鼠腸道免疫功能的調(diào)整作用。方法鹽酸林可霉素灌胃建立小鼠腸道菌群失調(diào)及免疫功能紊亂模型。昆明種鼠隨機分6組，正常對照組、自然恢復組、造模組、思密達組、加味四君子湯組和兩藥合用組，分別進展腸道菌群檢測、小腸黏液中sIgA的測定、血清中IL-2的測定及腸通透性(尿液中乳果糖與甘露醇比值)的檢測。結果鹽酸林可霉素灌胃3d小鼠，腸道菌群失調(diào)，sIgA從正常對照組的14.54g/l增加到18.70g/l，IL-2從正常對照組的1186.65g/l降低到1111.58g/l、L/從正常對照組的1.27增加到1.37g/l。實

2、驗組分別給加味四君子湯、思密達及兩藥合用后，腸道菌群得以調(diào)整，sIgA含量從18.70g/l降低到14.52g/l，IL-2的含量從1111.58g/l增加到1189.58g/l，腸黏膜通透性減校各治療組間比擬，加味四君子湯和思密達合用組優(yōu)于加味四君子湯組和思密達組。結論加味四君子湯和思密達均能修復受損黏膜，有調(diào)節(jié)腸道免疫功能的作用，但加味四君子湯在調(diào)整失調(diào)的菌群方面優(yōu)于思密達，兩藥合用給藥那么能起到最正確效果?！娟P鍵詞】腸道菌群；加味四君子湯；腸道免疫；腸通透性正常腸道屏障功能依賴于腸黏膜上皮屏障、腸道免疫系統(tǒng)以及腸道的正常微生物的平衡1。近年來，很多學者開場研究四君子湯對腸道菌群的調(diào)整作用

3、，鞠寶玲、李儉等2，3研究說明四君子湯可以改善脾虛大鼠胃腸黏膜的異常形態(tài)，使其恢復正常，并對雙歧桿菌和乳酸桿菌有明顯的增菌作用，從而調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)，治療由腸道菌群失調(diào)導致的一系列疾病，李莉等4研究了加味四君子湯對腸道菌群失調(diào)小鼠的調(diào)整作用，效果顯著。本文討論山藥參加四君子湯對腸道菌群的調(diào)整及機體免疫功能的調(diào)整作用。1材料與儀器1.2藥物與試劑鹽酸林可霉素300g/L,上海旭東海普藥業(yè)，批號：070509；思密達，博福-益普生制藥，批號：S0293；中藥：人參、山藥、白術、茯苓、甘草，購于張仲景大藥房，將上述中藥按22221混合，水提取，過濾濃縮至1g/l生藥量；生理鹽水，山東魯抗辰欣藥業(yè)；乳

4、果糖遼寧省丹東市康復制藥廠；甘露醇北京化工廠，進口分裝；甲基甘露糖苷SIGA；吡啶FLUKA；羥基鹽酸鹽SIGA；n-三甲基硅烷咪唑SIGA1.4儀器設備酶標儀(BI-RADdel680)；氣相色譜FULIG9790II配有FID檢測器，微機色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)SE-54，150.530.5毛細管柱。色譜分析條件：SE-54，150.53毛細管柱。初溫150，程序升溫I終溫220，速率10/in,程序升溫II終溫280，速率15/in，保持6in,注樣器的溫度220，檢測溫度300。載氣高純氮30l/in,燃氣氫氣30l/in，助燃空氣300l/in。2方法2.1動物分組、造模3及給藥方法昆明種小

5、鼠72只，體質(zhì)量1822g，雌雄各半。隨機取出12只作為正常對照組，其余用鹽酸林可霉素300g/l灌胃，每次0.3l，2次/d，連續(xù)3d，正常對照組灌等量生理鹽水。隨機取出12只作為模型組，立即處死，進展各種指標檢測。然后將剩余的48只隨機分為4組，分別灌以生理鹽水、思密達、加味四君子湯、及兩藥合用。中藥組和生理鹽水組，0.3l/次，2次/d，連續(xù)6d；思密達組0.06g/l，0.2l/次，2次/d，連續(xù)10d。各治療組及正常對照組給藥完成后處死小鼠，采集標本進展各種指標檢測。2.2腸道菌群檢測無菌采取小鼠鮮糞便約0.2g置于滅菌后帶玻璃珠的青霉素小瓶，加滅菌生理鹽水制成10倍的稀釋度，振蕩使

6、之均質(zhì)化，遞10倍稀釋至10-6，取25l分別接種在各類選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)EB培養(yǎng)基及E培養(yǎng)基放入需氧環(huán)境35培養(yǎng)1624h后計數(shù)，BLb培養(yǎng)基、LBS培養(yǎng)基和BD培養(yǎng)基放入?yún)捬醐h(huán)境35培養(yǎng)4872h之后計數(shù)6。根據(jù)菌落形態(tài)，涂片分析及耐氧實驗結果計算各菌群每克糞便中菌落形成單位FU/g。2.3小腸粘液sIgA測定取緊靠回盲部小腸腸段4，平鋪于濾紙上，縱向剖開刮取腸道內(nèi)容物及粘液于EP管中，參加1lPBS充分勻漿，4000r/in，30in，取上清，按ELISA試劑盒說明書進展粘液sIgA的測定，在450n處讀取相應的A值。2.4IL-2測定搜集眶后血管叢血液置于Eppdeffer管，37溫

7、箱中放置1h，4000r/in離心，取血清置于-80冰箱中保存，按試劑盒說明書進展血清IL-2的測定。2.5L/的測定5，7將乳果糖200g，甘露醇100g參加10l生理鹽水中配成混合溶液，以0.5l/只劑量灌胃。搜集服糖后6h尿液，置-20冷凍保存?zhèn)溆?。取待測尿樣100l參加試管內(nèi)，然后加125l內(nèi)標液，在充氮氣容器內(nèi)枯燥，再加100l肟溶液1l吡啶中參加25g羥基鹽酸鹽7530in，再加100ln-三甲基硅烷咪唑7515in，冷后取2l進展色譜分析。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.3結果3.1腸道菌群的定量檢測見表1。小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后，與正常對照組相比，5種腸道菌群發(fā)生顯著變化，其中雙歧桿菌

8、、乳酸桿菌、腸桿菌數(shù)量顯著降低，而腸球菌、類桿菌數(shù)量有所升高。經(jīng)各組治療后，各種細菌根本恢復到正常程度，其中加味四君子湯組效果最好，與正常對照組已無差異P0.05。表1小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃和藥物處理后腸群檢測結果(略)3.2sIgA和IL-2的測定結果見表2。小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后，sIgA增高，IL-2降低，經(jīng)加味四君子湯和思密達治療后，sIgA和IL-2的含量趨于恢復到正常程度，其中以加味四君子湯和思密達組恢復的最好。3.3尿液中L/的測定正常對照組的小鼠尿液中L/的峰面積比值為1.2754494.881269.08/42973.021266.39。結果見圖1，而灌胃3d鹽酸林可霉素后

9、，L/的峰面積值升高到1.3758894.8831627.90/42988.966741.20。見圖2。表2小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃和藥物處理后小腸黏液sIgA和血清IL-2含量測定結果(略)4討論乳果糖通過小腸黏膜上皮細胞的嚴密連接處吸收，乳果糖的吸收與小腸黏膜上皮細胞的嚴密連接完好程度成反比；甘露醇通過小腸上皮細胞膜上的水溶性微孔吸收。兩者在小腸內(nèi)不代謝，直接吸收入血，然后由尿中排出，可從尿中進展定量測定其吸收量。假如尿中L/的值升高，即說明上皮細胞間的構造已發(fā)生改變，黏膜的通透性增加。本文結果說明，小鼠經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后，L/值增高，黏膜有損。經(jīng)加味四君子湯和思密達治療后，L/值又降低到

10、正常程度，黏膜的通透性降低。黏膜通透性降低說明破損的黏膜已經(jīng)根本得到修復，這與腸道菌群的調(diào)整也有很多關系。近年來，國外學者7采用多種糖來檢測胃腸道黏膜的通透性，其中比擬常見的為三氯蔗糖，它可以全面反映胃腸道的通透性，對于其在本實驗中的應用還有待于進一步研究。IL-2是參與免疫應答的重要細胞因子，并參與炎癥反響。sIgA參與機體部分免疫，在呼吸道、消化道黏膜防御機制中發(fā)揮重要作用8。梁慶紅等9用卡那霉素50g小鼠灌胃，連續(xù)10d，建立了小鼠腸道菌群失調(diào)模型，觀察到血清IL-2、IL-3的含量低于對照組。劉崇海等10給小鼠口服頭孢哌酮7d后經(jīng)口給予白色念珠菌，誘導腸道菌群失調(diào)，檢測脾指數(shù)、PHA誘

11、導的淋巴細胞轉化率、遲發(fā)型變態(tài)反響、抗體生成細胞數(shù)和脾臟的TLR2和TLR4基因表達程度均低于對照組。石梅等11用鹽酸林可霉素、頭抱哇林鈉及氨節(jié)西林鈉混合液各藥濃度均為100g/l小鼠灌胃，0.2l/只，2次/d，連續(xù)3d，小鼠腸道菌群失調(diào)后導致其免疫器官指數(shù),血清免疫球蛋白IgA，Ig，IgG含量,淋巴細胞轉化率和單核一巨噬細胞吞噬率均極顯著下降。這些研究說明，菌群紊亂可引起機體免疫功能低下或紊亂。本文結果說明，經(jīng)鹽酸林可霉素灌胃后，小鼠血清IL-2含量降低，與上述結果一致；小腸黏液sIgA含量增高，可能與本文抗菌藥用量相對低和時間短，紊亂菌群刺激腸道部分黏膜免疫系統(tǒng)，sIgA分泌量增加有關

12、。本實驗應用鹽酸林可霉素造成小鼠腸道菌群失調(diào)，其中腸道有益菌雙歧桿菌和乳酸桿菌，及腸桿菌數(shù)量下降，而類桿菌和腸球菌數(shù)量升高。小腸黏液中sIgA的含量增高，血清中IL-2含量降低，尿液中L/的比值增高，這些變化均顯示小鼠腸道的部分屏障功能和全身免疫功能紊亂。經(jīng)加味四君子湯調(diào)整后，腸道菌群根本恢復正常；思密達組對腸道菌群的調(diào)整作用效果不明顯，但對腸黏膜的修復效果較好。加味四君子湯和思密達合用組無論是在對腸道菌群的調(diào)整方面，還是在調(diào)整腸道免疫功能方面都有較好的效果。這提示在應用抗菌藥物的同時，可適當加服一些能對腸道菌群有調(diào)整作用和對腸道免疫功能有調(diào)整作用的制劑，預防內(nèi)源性感染?！緟⒖嘉墨I】1Heht

13、G.Innateehanisesfepithelialhstdefense;sptlightnintestineJ.AJPhysil,1999,277:351.2鞠寶玲，陸葉，唐小云，等.四君子湯及其納米制劑對微生態(tài)失調(diào)小鼠的調(diào)整作用J.中國微生態(tài)學雜志，2022，19(1):6.3李儉，王琳，楊景云，等.四君子湯對免疫抑制小鼠肝臟細菌易位的影響J.中國微生態(tài)雜志，2022，172：102.4李莉，白曉玲.加味四君子湯對失調(diào)小鼠腸道菌群的調(diào)整作用J.中華臨床醫(yī)學研究雜志，2022，137：850.5祝小楓，熊德鑫，盛志勇，等.腸通透性改變的檢測，第1版J.解放軍醫(yī)學雜志，1997，222：150.6羅予，馮羨菊.臨床厭氧菌檢測及圖解.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社，2022：74.7AshkanFarhadi,AliKeshavarzian,JereyZ.Fields,alihaShEikh,AliBanan.ReslutinfndietarysugarsfrprbesugarsfrtestfintestinalpereabilityusingapillarylungashratgraphyJ.JurnalfhratgraphyB,2022，83612：63.8BulbergRS,Strber.PrspetsfrresearhininflaatinbldiseaseJ.JA