化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (4)講稿

1、關(guān)于化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù) (4)第一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型四、臨床應(yīng)用五、發(fā)展與展望第二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的概念 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)：化學(xué)發(fā)光分析是根據(jù)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的輻射光的強(qiáng)度來確定物質(zhì)含量的分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用化學(xué)發(fā)光相關(guān)的物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，與待測(cè)的抗原或抗體反應(yīng)后，經(jīng)過分離游離態(tài)的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物，加入化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的其它相關(guān)物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，進(jìn)行抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)。 第三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2

2、022年6月 化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定是目前世界公認(rèn)先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和特異性，成為檢驗(yàn)方法中最為重要的技術(shù)之一。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)作為疾病診斷的主要手段已被廣泛用于機(jī)體免疫功能、傳染性疾病、內(nèi)分泌功能、腫瘤標(biāo)志物、性激素、甲狀腺功能等方面的體外診斷實(shí)驗(yàn)中。第四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)發(fā)光免疫分析的優(yōu)勢(shì)靈敏度高靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達(dá) 10-22 mol/L （ RIA 為 10 -12 mol/L ）。化學(xué)發(fā)光免疫分析能夠檢出放射免疫分析和酶聯(lián)免疫分析等方法無法檢出的物質(zhì)，對(duì)疾病的早期診斷具有十分重要的意義

3、。 第五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍 發(fā)光強(qiáng)度在 4 6 個(gè)量級(jí)之間與測(cè)定物質(zhì)濃度間呈線性關(guān)系。這與顯色的酶免疫分析吸光度（ OD 值）為 2.0 的范圍相比，優(yōu)勢(shì)明顯。雖然 RIA 也有較寬的線性動(dòng)力學(xué)范圍，但放射性限制了其應(yīng)用。 光信號(hào)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)輝光型的 CLIA 產(chǎn)生的光信號(hào)持續(xù)時(shí)間可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至一天。簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作及測(cè)量。 第六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分析方法簡(jiǎn)便快速絕大多數(shù)分析測(cè)定均為僅需加入一種試劑（或復(fù)合試劑）的一步模式。 結(jié)果穩(wěn)定、誤差小樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，免除了各種可能因素（光源穩(wěn)定性、光散射、光波選擇器等

4、）給分析帶來的影響，使分析結(jié)果靈敏穩(wěn)定可靠。 安全性好及使用期長(zhǎng)免除了使用放射性物質(zhì)。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)其危害性；試劑穩(wěn)定，保存期可達(dá)一年。 第七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、化學(xué)發(fā)光免疫分析基本原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析包含兩個(gè)部分, 即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 經(jīng)過特異性免疫反應(yīng)后,形成抗原2抗體復(fù)合物。然后進(jìn)行對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè), 來測(cè)定待檢物?；瘜W(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化, 形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體, 當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí), 同時(shí)發(fā)射出光子, 利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器光量子產(chǎn)率。第

5、八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2.1 免疫分析原理 免疫分析是利用抗原與抗體特異性結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合物而建立起來的一種高選擇性的分析方法, 根據(jù)其檢測(cè)方法可分為非標(biāo)記免疫分析和標(biāo)記免疫分析。非標(biāo)記免疫分析是利用抗原與抗體結(jié)合形成抗原2抗體復(fù)合物后, 其理化性質(zhì)發(fā)生改變,出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集等現(xiàn)象,利用這些現(xiàn)象來檢測(cè)待檢物。標(biāo)記免疫分析是在不影響抗原、抗體生物活性的基礎(chǔ)上將標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記在抗原或抗體上, 然后進(jìn)行免疫反應(yīng)形成抗原2抗體復(fù)合物, 再對(duì)標(biāo)記質(zhì)進(jìn)行檢測(cè), 從而間接檢測(cè)待檢物的方法 。目前常用的標(biāo)記物有放射性的125 I, 非放射性的堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶, 鑭系

6、稀土元素等。第九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2.2 化學(xué)發(fā)光原理 化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence, CL)是化學(xué)物質(zhì)在特定化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的光輻射。通過高能中間體的分解在化學(xué)反應(yīng)中激發(fā)單態(tài)分子形成,分子被激發(fā)后是不穩(wěn)定的,它要釋放出多余的能量而回到基態(tài),其中部分的能量以發(fā)光形式釋放出來。因此,任何一個(gè)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)包括兩個(gè)過程:激發(fā)和發(fā)光過程。一些激發(fā)態(tài)分子能量也會(huì)通過系間串躍和系內(nèi)串躍而消失。因此,化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率是:第十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 CL =CEEM (1) 式中,CL為化學(xué)發(fā)光效率,CE為生成激發(fā)態(tài)的效率, EM為激發(fā)態(tài)的發(fā)光效率。

7、CE和EM分別定義為：CE = 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (2)EM = 發(fā)光的分子數(shù)/ 生成激發(fā)態(tài)的分子數(shù) (3) 從(1) 、(2) 、(3) 式得化學(xué)發(fā)光的效率CL等價(jià)于生成熒光和磷光的量子效率。即: CL = 發(fā)光的分子數(shù)/ 參加反應(yīng)的分子數(shù) (4)第十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2.3 化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理 化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光和免疫分析結(jié)合的產(chǎn)物。它同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏度和免疫分析法的高選擇性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的試劑標(biāo)記抗原或抗體, 標(biāo)記后的抗原和抗體與待測(cè)物經(jīng)過一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟,最后以測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度形式測(cè)定待測(cè)

8、物的含量。第十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月三、化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析法根據(jù)其標(biāo)記物的不同可分為三大類,即化直接化學(xué)發(fā)光免疫分析、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析和電化學(xué)發(fā)光免疫分析法。第十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的

9、含量。3.1 直接化學(xué)發(fā)光免疫分析第十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶吖啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后- 夾心法（1）加入H2O2（pH10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理第十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)第十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶

10、（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)并加以放大，再把它們傳送至計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出測(cè)定物的濃度。3.2、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析第十七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑使

11、產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析第十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 第十九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶 標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測(cè)標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團(tuán)而發(fā)光。 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析第二十張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 第二十一張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月分析步驟分配樣品,磁顆粒和試劑

12、孵育使反應(yīng)物結(jié)合在磁場(chǎng)中清洗去除未結(jié)合物質(zhì)加入底物產(chǎn)生信號(hào)孵育,促使信號(hào)的產(chǎn)生信號(hào)檢測(cè)第二十二張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記 抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場(chǎng)中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光 反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個(gè)過程。 3.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析第二十三張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測(cè)標(biāo)本與相應(yīng)的

13、抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測(cè)抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)將上述復(fù)合物吸入流動(dòng)室，同時(shí)引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時(shí)，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時(shí)電極加壓，啟動(dòng)電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強(qiáng)度與待測(cè)抗原的濃度成正比。第二十四張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖第二十五張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定示意圖第二十六張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月標(biāo)記磁顆粒在電場(chǎng)中發(fā)光工作示意圖第二十

14、七張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、臨床應(yīng)用1.甲狀腺激素 2.生殖激素3.腎上腺/垂體激素 4.貧血因子5.腫瘤標(biāo)記物 6.感染性疾病7.糖尿病 8.心血管系統(tǒng)9.病毒標(biāo)記物 10.骨代謝11.過敏性疾病 12.治療藥物監(jiān)測(cè) 第二十八張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月五、發(fā)展與展望 化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測(cè)中得到了廣泛運(yùn)用。實(shí)際檢測(cè)常常需要對(duì)大量、復(fù)雜、低豐度的樣品進(jìn)行測(cè)定，因而化學(xué)發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測(cè)的方向發(fā)展。近幾年化學(xué)發(fā)光免疫分析法的研究方向主要涉及到降低溫育時(shí)間，多組分檢測(cè)，以及信號(hào)放大技術(shù)等。這些例子都證明了化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有廣泛的應(yīng)用前景和可操作性。第二十九張，PPT共三十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 此外，化學(xué)發(fā)光成像技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫分析與分離技術(shù)的聯(lián)用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度和檢測(cè)速度、檢測(cè)通量得到進(jìn)一步提高。為了更好地適應(yīng)臨床、環(huán)境等領(lǐng)