基礎(chǔ)學(xué)習(xí)實驗 7-DNS-AA雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離Hb與魚精蛋白課件

1、轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點預(yù)測分析DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析 凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白DNA親和層析分離目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子蛋白綜合性設(shè)計性實驗-7此實驗共包括如下三個部分第一部分，轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點預(yù)測分析第二部分， DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析、凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白第三部分，DNA親和層析分離目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子蛋白第一部分，轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點預(yù)測分析基因表達(dá)的調(diào)控關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)錄起始水平的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測是研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。準(zhǔn)確的預(yù)測將有助于人們認(rèn)識和研究不同轉(zhuǎn)錄因子對目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的時空性。第二部分， DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分

2、離血紅蛋白與魚精蛋白背 景層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。葉綠素通過碳酸鈣管柱所形成的色譜圖按層析過程的機(jī)理分類：分配層析: 根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法稱為分配層析

3、。吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質(zhì)在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析: 是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)酸堿度、極性和分子大小差異而將物質(zhì)予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力的層析技術(shù)。層析法分類層析法分類按兩相所處的狀態(tài)分類：流動相有兩種狀態(tài)：液體作為流動相 氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相 以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相

4、所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析 流動相固定相 液體 （液相層析) 氣體 （固相層析） 液 體 液-液層析氣-液層析 固 體 液-固層析氣-固層析層析法分類名稱操作形式適用范圍柱層析將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達(dá)到分離的目的。柱層析是常用的層析形式，適用于大量樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。薄層層析將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用。按操作形式不同分類：吸附層析原理：任何兩個相都可以形成表面，其中一個相的

5、物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質(zhì)聚集到自己表面的物質(zhì)稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學(xué)作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時中被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。分配層析技術(shù) （液-液層析法）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。特點：液-液層析法適合于分離同系物或

6、同分異構(gòu)體分配層析技術(shù)相關(guān)的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的， Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。Rf =色斑中心至原點中心的距離溶劑前緣至原點中心的距離親和層析法親和層析（Affinity Chromatography）是利用生物分子間專一性親和力而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。如我們熟悉的：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。親和層析的分離原理簡單的說就是通過將具有親和力的兩個分子中一個固定在不溶性基質(zhì)上，利用分子間

7、親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。 親和層析可用于純化生物大分子、稀釋液的濃縮、不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的貯藏、從純化的分子中出去殘余的污染物、用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補(bǔ)配體的生物大分子，分離核酸是親和層析應(yīng)用的重要方面。親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。缺點是針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件限制了其使用。離子交換層析離子交換層析是依據(jù)各種離子或離子化合物與離子交換劑的結(jié)合力不同而進(jìn)行分離純化。離子交換層析的固定相是離子交換劑，它是由一類不溶于水的惰性高分子聚合物基質(zhì)通過一定的化學(xué)反應(yīng)共價結(jié)合上某種電荷基團(tuán)形成的。

8、離子交換劑包括交換樹脂和交換纖維素兩種。離子交換劑可以分為三部分：高分子聚合物基質(zhì)、電荷基團(tuán)和平衡離子。電荷基團(tuán)與高分子聚合物共價結(jié)合，形成一個帶電的可進(jìn)行離子交換的基團(tuán)。平衡離子是結(jié)合于電荷基團(tuán)上的相反離子，它能與溶液中其它的離子基團(tuán)發(fā)生可逆的交換反應(yīng)。平衡離子帶正電的離子交換劑能與帶正電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陽離子交換劑；平衡離子帶負(fù)電的離子交換劑與帶負(fù)電的離子基團(tuán)發(fā)生交換作用，稱為陰離子交換劑。凝膠層析技術(shù)概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當(dāng)生物大分子隨流動相通過裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被

9、分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。凝膠層析的基本概念外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。我們設(shè)柱床體積為Vt

10、，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：VtVoViVg 由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：VtVoVi 凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）外水體積（V0）內(nèi)水體積（Vi）基質(zhì)體積（Vg）基質(zhì)體積（Vt）原理聚酰胺薄膜層析是一類特殊的分配層析。混合物隨流動相通過聚酰胺薄膜時，由于被分離物質(zhì)與薄膜形成氫鍵，而各物質(zhì)形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強(qiáng),展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。展層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺離子表面競爭形成氫鍵，選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有最大差異。易溶于展層劑的所受的動力作用大，展層速度快，反之，速

11、度慢。 DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析本實驗中，聚酰胺上的氨基與氨基酸（AA）的羰基形成氫鍵，酰胺基團(tuán)上羰基與AA中羥基或酚基形成氫鍵。由于有些AA結(jié)構(gòu)相似，如只采用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行單向?qū)游?，難達(dá)到完全分離的目的。因此可選擇另一溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二向?qū)游?。這種層析方法稱為雙向?qū)游觥?第一向：苯冰醋酸溶劑 第二向：甲酸水顯色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黃色熒光。DNS-Cl + AADNS-AA + HCl實驗操作DNS-氨基酸的制備（已完成）混合DNS氨基酸的雙向?qū)游鳇c樣：在薄膜右下角距兩邊各0.6cm，直徑控制在

12、23mm之間，點在無光澤面，可重復(fù)點樣2-3次；苯冰醋酸層析：將點好樣品的薄膜用回形針固定放入展層劑中，展層劑前緣在距薄膜頂端2mm處即可停止,冷風(fēng)吹干，紫外燈下觀察；甲酸水層析：調(diào)轉(zhuǎn)90度與第一相垂直，放入展層劑中，熱風(fēng)吹干，紫外燈下觀察，用鉛筆輕輕標(biāo)記（以免損壞薄膜表面）；分析實驗結(jié)果；將層析后標(biāo)記好的薄膜以點樣點為左下角貼于實驗報告中。3、操作注意事項：嚴(yán)格控制點樣位置以及點樣直徑。展層時勿將點樣點浸入展層劑中。展層后必須經(jīng)電吹風(fēng)將膜吹干。紫外光對眼睛有害不要把頭伸到燈下觀察。頡亮苯丙賴甘絲天脯谷DNS-氨基酸的雙向?qū)游鲱A(yù)期實驗結(jié)果實驗原理由于Hb（紅色，分子量64500）與二硝苯-魚精

13、蛋白（黃色，分子量2000-12000）的分子量不同，通過交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50（sephadex）層析柱用蒸餾水洗脫分離。從顏色不同可直接觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l,3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑將鏈狀結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨

14、脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5ml，G-100表示 1g干膠持水10ml，依次類推。裝柱前準(zhǔn)備: 先用自來水洗凈,再用蒸餾水洗凈,之后往層析柱加入2-3ml蒸餾水,以確保凝膠底部沒有氣泡；裝柱：垂直裝柱，待凝膠裝至柱高的10-15cm即可（裝柱的時候注意要不斷混勻凝膠）。注意防止氣泡與分層, 否則重新裝柱?？捎貌０魯嚢枋贡砻嫫秸?；平衡：反復(fù)加蒸餾水,平衡10分鐘.使蒸餾水維持在3-4cm高度；加樣：待蒸餾水流至柱平面時（不可使柱平面干掉），馬上靠近柱平面小心滴加4滴樣品（注意盡量不要使床面攪動），待樣品浸入到凝膠中后馬上加入34滴蒸餾水(動作輕