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文檔簡(jiǎn)介

1、 乙醛脫氫酶2對(duì)肥胖大鼠心肌的影響 于曉涵Summary:隨著國(guó)民生活水平的提高,高脂飲食伴隨的生活習(xí)慣逐漸成為大眾主流。研究發(fā)現(xiàn)乙醛脫氫酶2(ALDH2)是一種在心肌保護(hù)方面具有重要作用的醛類氧化酶,能夠改善心肌損傷和動(dòng)脈粥樣硬化等。因此,該實(shí)驗(yàn)通過(guò)高脂飲食構(gòu)建肥胖大鼠模型,探討ALDH2和心肌保護(hù)間的關(guān)系。Key:高脂飲食;心肌;乙醛脫氫酶21 前言社會(huì)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,帶動(dòng)了國(guó)民的物質(zhì)水平不斷提高。中國(guó)居民的膳食習(xí)慣正在向以高脂飲食為主的西方膳食模式轉(zhuǎn)變,特別是在大城市,這種現(xiàn)象更為顯著。伴隨著人們膳食金字塔的改變,一系列慢性病的發(fā)病率不斷攀升,尤其是長(zhǎng)期進(jìn)食高脂食物可以增加冠心病的發(fā)病

2、率。流行病學(xué)資料顯示,中國(guó)城市居民冠心病死亡率高達(dá)88.71/10萬(wàn),以每年20%的速度增長(zhǎng)。并且出現(xiàn)地區(qū)和性別差異,城市高于農(nóng)村,男性高于女性,在發(fā)達(dá)的沿海城市這種情況更為顯著1。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是由冠狀動(dòng)脈血管變窄或被阻塞使得心肌缺氧或梗死而引起的心臟病,簡(jiǎn)稱冠心病,又被稱為缺血性心臟病。過(guò)量攝入高脂食物后,會(huì)造成膽固醇和甘油三脂長(zhǎng)期處于高水平狀態(tài),容易使動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化,引發(fā)心臟內(nèi)的血液供給不足,致使心肌受損,最終引發(fā)冠心病。由于高脂食物中含有較多的飽和脂肪酸,經(jīng)科學(xué)證實(shí)攝入飽和脂肪酸的量越多,冠心病的患病率就越大,二者呈正相關(guān)。冠心病已經(jīng)影響到人類的生活質(zhì)量,成為影響身體健康的

3、首要危險(xiǎn)因素。因此如何降低高脂飲食模式對(duì)冠心病的發(fā)病率是目前亟待解決的重要問(wèn)題。乙醛脫氫酶(ALDH)是醛脫氫酶中的一種,包含19個(gè)成員,每個(gè)成員由不同的染色體上基因編碼。ALDH一共包括三類,存在于線粒體上的乙醛脫氫酶2(ALDH2)是其中的第二類。ALDH2是一種重要的醛類氧化酶,具有脫氫酶和酯酶的功能,能夠催化乙醇的代謝產(chǎn)生乙醛并將其氧化為醋酸,然后將乙醛衍生物4-羥壬烯醛(4-HNE)氧化分解,生成無(wú)毒的酸,減輕活性氧和醛類氧化酶生成對(duì)細(xì)胞造成的損傷2。研究表明,ALDH2是不僅是酒精代謝的關(guān)鍵酶,還可以保護(hù)由氧化應(yīng)激造成的細(xì)胞損傷。另有研究表明,在缺血再灌注損傷中,隨著ALDH2活性

4、的提高,心梗出現(xiàn)的面積就越小,呈現(xiàn)反關(guān)系,證實(shí)ALDH2具有改善心臟功能,保護(hù)心肌的重要作用。目前關(guān)于冠心病與ALDH2的基因多態(tài)性之間的關(guān)系有很多研究。從它的生物學(xué)特性來(lái)看,ALDH2基因的12 號(hào)外顯子的鳥嘌呤突變?yōu)橄汆堰蕰r(shí),此時(shí)谷氨酸被替換為賴氨酸,根據(jù)該突變,ALDH2基因型在人群中就形成了3種組合方式:GG型(野生純合子)、GA型(雜合子)和AA型(突變純合子)。國(guó)內(nèi)外在這兩者的關(guān)系上有大量研究,有研究者選取了89名心梗患者和142名不穩(wěn)定型心絞痛患,把231名患者分為ALDH2*1/ALDH2*1型(n=145)和ALDH2*1/ALDH2*2,ALDH2*2/ALDH2*2型(n

5、=86)兩組,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型患者心梗發(fā)病率高于野生型患者。日本的一項(xiàng)研究顯示,ALDH2突變基因型成為了日本男性心梗的危險(xiǎn)因素之一。但是進(jìn)一步研究顯示,ALDH2的突變型基因只是心梗發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素,與冠狀動(dòng)脈損傷的嚴(yán)重等級(jí)沒(méi)有關(guān)聯(lián)。研究提示,存在ALDH2*2等位基因的人患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)更高,并且攜帶ALDH2*2的基因是心肌梗死和急性冠脈綜合癥中的主要危險(xiǎn)因子,可能與ALDH2 活性降低后導(dǎo)致體內(nèi)脂質(zhì)積累、蛋白質(zhì)合成受阻、活性氧增加等因素有關(guān),不過(guò)具體的機(jī)制尚未明確。在既往的研究中顯示,ALDH2活性的提高可以減慢動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展,減輕乙醇對(duì)肝臟的損傷,減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生,對(duì)酒精中毒

6、可以起到解毒和治療的作用。總結(jié)以上探究,ALDH2與心血管疾病密切相關(guān),如冠心病,缺血再灌注損傷等。所以研究ALDH2在心血管疾病治療方面的作用具有很重要的臨床價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)高脂飲食構(gòu)建肥胖大鼠模型,同時(shí)結(jié)合血清中總膽固醇(TC)和肌酸激酶(CK)的變化,探討ALDH2和心肌保護(hù)間的關(guān)系,為臨床降脂和心肌保護(hù)提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2 材料與方法2.1材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠雄性24只,2月齡,體重約290g。購(gòu)于湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。所有大鼠均自由進(jìn)食,室溫 214攝氏度下飼養(yǎng)。2.1.2儀器和試劑其林貝爾脫色搖床;垂直電泳槽1.5MM標(biāo)配;VE-180轉(zhuǎn)移電泳槽;高壓電泳儀電

7、源;多功能酶標(biāo)儀;超級(jí)恒溫水浴鍋;小型冷凍高速離心機(jī);電磁攪拌器;上海勤翔超敏熒光及化學(xué)反應(yīng)儀;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī);優(yōu)普超純水制造系統(tǒng);制冰機(jī)。由武漢萬(wàn)知生物有限公司提供BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒;南京建成生物有限公司提供總膽固醇和肌酸激酶試劑測(cè)試盒。2.1.3 取材在干預(yù)后用戊巴比妥鈉麻醉后,取心肌組織于-80冰箱中冷凍。通過(guò)眼球取血5ml靜置30min后放于4冷柜過(guò)夜,隔天用1000轉(zhuǎn)/分鐘*10分鐘的模式進(jìn)行離心,離心后取上層血清保存于-20的低溫環(huán)境中。2.2方法2.2.1高脂乳劑的配制取500ml規(guī)格的燒杯,將20g豬油放在燒杯中用磁力攪拌器加熱到100后,加入2g膽固醇,用玻璃棒不斷

8、攪拌使其熔化,再加入2g膽酸鈉攪拌使其溶解。再取一個(gè)500ml規(guī)格的燒杯,把20ml吐溫-80和20ml丙二醇倒入燒杯中用磁力攪拌器加熱至60,然后加入1g丙硫氧嘧啶。等到丙硫氧嘧啶充分溶解后,將兩個(gè)燒杯中的液體混勻。2.2.2實(shí)驗(yàn)分組適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后的大鼠隨機(jī)抽取8只作為普食對(duì)照組(ND)提供標(biāo)準(zhǔn)飼料,另外16只給予高脂乳劑。并再將其隨機(jī)分為兩組,即高脂對(duì)照組(持續(xù)灌高脂乳劑,HR)、飲食限制組(DR,前四周喂食高脂乳劑,后四周喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料)。八周后進(jìn)行取材。2.2.3 總膽固醇指標(biāo)檢測(cè)南京建成公司試劑盒提供的酶標(biāo)儀測(cè)試方法:在空白孔,標(biāo)準(zhǔn)孔和校準(zhǔn)孔中分別加入2.5微升的雙蒸水,標(biāo)準(zhǔn)品和樣本

9、;接著將所有孔中加入250微升的工作液;混勻96孔板中各孔的液體;37孵育10分鐘;用酶標(biāo)儀設(shè)置510nm的參數(shù);依據(jù)公式計(jì)算吸光度。2.2.4 肌酸激酶活力測(cè)試南京建成公司試劑盒提供的酶標(biāo)儀測(cè)試方法:測(cè)定管中加入20微升的待測(cè)樣本;接著將300微升的混合試劑分別加入測(cè)定管和對(duì)照管中;振蕩混勻,37攝氏度,水浴20分鐘。水浴之后,在對(duì)照管中加入20微升的待測(cè)樣本,接著把試劑六分別加入兩種管里,振蕩混勻,每分鐘500轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)10分鐘,取上清加入定磷劑。混勻兩個(gè)管中的液體,浴調(diào)至45加熱15分鐘。雙蒸水調(diào)零設(shè)定參數(shù)660nm,測(cè)各管的吸光度。2.2.5 Western blot法測(cè)定ALDH2蛋白表

10、達(dá)提取心肌組織中的總蛋白:稱取大鼠心肌組織,將其剪成小塊;加入蛋白酶抑制劑液和蛋白裂解液2ml,充分研磨;用超聲將細(xì)胞裂解后離心10分鐘,離心后用取上清;加入Loading Buffer后煮樣5分鐘;BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制SDS凝膠:配制前將兩塊玻璃板安裝完畢,將配好得分離膠試劑(去離子水,2-丙烯酰胺,Tris-Hcl 8.8PH,SDS,過(guò)硫酸銨AP,TEMED)快速混勻,抓緊注入玻璃板間隙,直至玻璃板2/3高度,蒸餾水封膠,靜置半小時(shí)后,倒掉水;接著把濃縮膠混合液(去離子水,2-丙烯酰胺,Tris-Hcl 6.8PH,SDS,過(guò)硫酸銨AP,TEMED)注入玻璃板間隙中直至小玻璃板位置

11、;插入梳子,靜置1小時(shí)后上樣。電泳:85v電壓下跑膠。轉(zhuǎn)膜:撬開(kāi)兩塊玻璃,去掉上層濃縮膠,只留分離膠,將分離膠放入轉(zhuǎn)膜液中;在轉(zhuǎn)膜夾上按順序放上海綿2層,濾紙3層,SDS凝膠,NC膜,濾紙3層,將其移入含有轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中;接通電源,350mA恒流跑90分鐘。封閉:將NC膜取出放入封閉液中,搖床封閉1小時(shí),封閉結(jié)束后在TBST液中清洗25分鐘。孵育一抗:將NC膜按照所需的目的蛋白的分子量進(jìn)行裁剪;剪好的條帶放入到用5%BSA稀釋過(guò)的一抗中,放入冰柜中低溫?fù)u床過(guò)夜。孵育二抗:取出抗體中的條帶,在TBST液中漂洗3遍,每遍15分鐘;接著放入稀釋后的二抗中,室溫下?lián)u床孵育2小時(shí);孵育結(jié)束之后,重復(fù)上

12、面步驟。曝光:按照A:B=1:1提前配制好ECL發(fā)光劑,避光保存;將條帶放進(jìn)超敏化學(xué)反應(yīng)儀中,加上發(fā)光劑,進(jìn)行曝光。2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值標(biāo)準(zhǔn)差表示,進(jìn)行單因素方差分析;各指標(biāo)間相關(guān)采用Person相關(guān)分析。統(tǒng)計(jì)分析用GraphPad Prism 5和SPSS 20.0軟件處理,P0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果3.1 血清總膽固醇(TC)指標(biāo)與普食對(duì)照組相比,高脂對(duì)照組的TC值顯著升高(P0.05),并且超過(guò)正常范圍的參考值;與飲食限制組相比,高脂對(duì)照組的TC值顯著升高(P0.05)。3.2血清肌酸激酶(CK)活性測(cè)試高脂對(duì)照組和飲食限制組的CK值較普食對(duì)照組顯著升高,差異具有統(tǒng)

13、計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.3 Western blot檢測(cè)ALDH2的蛋白表達(dá)高脂對(duì)照組ALDH2表達(dá)較普食對(duì)照組顯著降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);高脂對(duì)照組ALDH2表達(dá)較飲食限制組明顯降低,差異具有顯著性(P0.05)。3.4指標(biāo)間相關(guān)分析TC和CK指標(biāo)之間具有相關(guān)性(P0.05);TC和ALDH2指標(biāo)之間具有相關(guān)性(P0.05);CK和ALDH2指標(biāo)之間具有相關(guān)性(P1.5。限制富含膽固醇多的食物,可以多吃洋蔥,大蒜,香菇之類的可以降低膽固醇的食物。以谷物為主;多吃新鮮的瓜果蔬菜,保證各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的均衡攝取。清淡飲食,少鹽少油。限制飲酒量,研究顯示適量飲酒可以提高ALDH2的活性,保護(hù)心臟,過(guò)度的飲酒則會(huì)增加高血壓,心力衰竭,腦猝死的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),積極參加體育運(yùn)動(dòng),已有研究證實(shí),運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防心血管疾病的發(fā)生并改善疾病程度。本研究通過(guò)總膽固醇和肌酸激酶兩個(gè)指標(biāo)判斷心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn),仍需要結(jié)合病理形態(tài)學(xué)觀察。證實(shí)高脂飲食的攝入使得心肌乙醛脫氫酶2表達(dá)下降,但是具體的調(diào)控其蛋白表達(dá)的分子信號(hào)通路不清楚。5 結(jié)論八周高脂飲食可引起大鼠血清中總膽固醇和肌酸激酶的水平升高,心肌ALDH2蛋白表達(dá)下降,提示心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加。盡早調(diào)整飲食結(jié)構(gòu),減少高脂食物的攝入,可以降低血清總膽固醇水平,增加心肌ALDH2蛋白表達(dá),從而降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。Re

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