DNA甲基化與癌癥

1、DNA甲基化與癌癥.07.25第1頁 表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化 DNA甲基化檢測伎倆 DNA甲基化與癌癥第2頁一、表觀遺傳學(xué)與DNA甲基化第3頁第4頁基因型相同現(xiàn)象1：一個(gè)生物體不一樣組織基因表示模式截然不一樣表示模式迥異第5頁現(xiàn)象2：同卵雙生孿生子含有完全相同基因組。但他們往往在長大成人后在性格、健康方面往往存在很大差異。第6頁 現(xiàn)象3： 腫瘤抑制基因被過量地甲基化而造成失去活性，而基因DNA序列并不發(fā)生改變。 第7頁現(xiàn)象4：橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相同，其實(shí)味不一樣。同一個(gè)水果，在不一樣產(chǎn)地生長，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。第8頁Basket ball player？Sin

2、ger？President？TV host？假如他們出生在不一樣地方第9頁基因環(huán)境表型表觀遺傳學(xué)第10頁相同基因型 不一樣表型 ? 第11頁 什么是表觀遺傳學(xué)？ 表觀遺傳學(xué)： 基因序列無改變 基因功效發(fā)生改變 可遺傳而且是可逆 表觀遺傳學(xué)機(jī)制： DNA甲基化 組蛋白修飾 RNA調(diào)控（RNA干擾，microRNA, long non-coding RNA等)第12頁表觀遺傳學(xué)/Epigenetics 基因型不變情況下，影響表型并能遺傳現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究是在基因組DNA序列不變情況下，在表型上含有穩(wěn)定、可遺傳(或潛在可遺傳性)改變。 定義Epigenetics - On

3、or over the genetic information encoded in the DNA第13頁在細(xì)胞基因組上存在兩類信息： A- 遺傳學(xué)信息 B- 表觀遺傳學(xué)信息前者維持細(xì)胞活性功效工廠全部物質(zhì)材料后者怎么建、何時(shí)建、在哪建附加信息基因組不但僅是序列包含遺傳信息，而且其修飾也能夠記載遺傳信息。第14頁DNA sequence codingEpigenetic programming表觀遺傳特點(diǎn)：廣泛，多樣，復(fù)雜第15頁DNA甲基化 染色質(zhì)重塑 RNA調(diào)控（RNA干擾， 非編碼RNA:microRNA, long non-coding RNA等)表觀遺傳學(xué)當(dāng)前主要研究發(fā)覺第16頁細(xì)

4、胞命運(yùn)個(gè)體發(fā)育疾病發(fā)生表觀遺 傳調(diào)控基因選 擇表示表 觀 遺 傳 學(xué)基因表示前調(diào)控：DNA甲基化、基因印記、染色質(zhì)重塑基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控：ncRNA、miRNA、反義寡核苷酸、核糖開關(guān)RNA蛋白翻譯后修飾：組蛋白甲基化和乙?；?、非組蛋白共價(jià)修飾第17頁DNA甲基化組蛋白翻譯后修飾RNA機(jī)制第18頁甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移 到其他化合物過程,可形成各種甲 基化合物，或是對一些蛋白質(zhì)或核 酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。在生物系統(tǒng)內(nèi)，甲基化是經(jīng)酶催化 ，這種甲基化包括基因表示調(diào) 控、蛋白質(zhì)功效調(diào)整以及核糖核 酸(RNA)加工。甲 基 化第19頁DNA 甲基化概

5、念及機(jī)理1950年，Wyatt在Nature上首次指出測序結(jié)果表明DNA可能存在第5堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-MethylctosineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH第20頁DNMTs活性甲基化合物DNA甲基化能夠發(fā)生在腺嘌呤N-6位、 胞嘧啶N-4位、鳥嘌呤N-7位或胞嘧啶 C-5位等。但在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主 要發(fā)生在5-CpG-3C上生成5-甲基胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）作用下，將一個(gè)甲基添加在DNA分子中堿基上，最常見是加在

6、胞嘧啶上，由此形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。第21頁DNA甲基化位點(diǎn)CpG島或富含CpG島區(qū)域CpG雙核苷酸在人類基因組中分布很不均一，而在基因組一些區(qū)段，CpG保持 或高于正常概率，這些區(qū)段被稱作CpG島。CCAGGCCTGGCCTTGACAGGCGGGCGGAGCAGCCAGTGCGAGACAGGGAGGCCGGTGCGGGTGCGGGAACCTGATCC GGAGGCGGGGGCGGGGCGGGGGCGCAGCGCGCGGGGAGGGGCCGGCGCCCGCCTTCCTCCCCGGGGCCCTCCGGCG TCTGCACTGCAGGAGCGCGGGCGCGGCGCCCCAGCCAGCGC

7、GCAGGGCCCGGGCCCCGCCGGGGGCGCTTCCTCGCC CCGCGCGACCCGCTGCpG島特征：A、CpG島主要位于基因開啟子區(qū)，部分位 于基因第一個(gè)外顯子區(qū)； B、CpG島甲基化能夠直接造成相關(guān)基因表 觀遺傳學(xué)緘默。第22頁高等生物基因組甲基化特點(diǎn) 1）廣泛性 2）可遺傳性 3）可逆性 4）組織特異性第23頁CpG島(CpG islands) 在結(jié)構(gòu)基因5端附近調(diào)控區(qū)段， CG二聯(lián)核苷經(jīng)常以成簇串聯(lián)形式排列，含量大于50%。 預(yù)測軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.a

8、c.uk/Tools/emboss/cpgplot/廣泛性第24頁可遺傳性第25頁DNA 修復(fù)基因表示調(diào)整癌基因代謝 凋亡分化細(xì)胞周期DNA甲基化DNA甲基化功效第26頁DNA甲基化生物學(xué)意義DNA甲基化直接影響基因活化狀態(tài) DNA甲基化生物學(xué)意義在于： A、基因表示時(shí)空調(diào)控 B、保護(hù)基因組穩(wěn)定性表現(xiàn)：基因在不一樣時(shí)期不同身體部位特異表示I.有些基因在發(fā)育早期甲基化II.發(fā)育晚期被誘導(dǎo)去甲基化III.管家基因低甲基化IV.印記基因高甲基化第27頁CpG甲基化與轉(zhuǎn)錄活性成反比CpG島數(shù)目與基因密度相關(guān)人類基因組甲基化情況1%-2%人類基因組是CpG群人類基因組CpG島約為28890個(gè) 平均值為每

9、Mb含10.5個(gè)CpG島80%-90%CpG位點(diǎn)已被甲基化第28頁一、DNA甲基化干擾轉(zhuǎn)錄因子對DNA元件識別與結(jié)合序列特異性甲基化DNA結(jié)合蛋白與開啟子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白去乙?；福℉DAC）， 形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄 因子與開啟子區(qū)靶序列結(jié)合， 從而影響基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制沒有甲基化基因表示基因開啟子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合不能結(jié)合甲基化基因不表示甲基化第29頁二、序列特異性甲基化DNA結(jié)合蛋白與開啟子區(qū)甲基化CpG島結(jié)合，募集組蛋白 去乙?；福℉DAC），形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止轉(zhuǎn)錄因子與開啟子區(qū)靶序列結(jié) 合，從而影響基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制

10、Sin3AMeCP2開啟子基因轉(zhuǎn)錄因子基因表示開啟子基因基因不表示第30頁染色質(zhì)構(gòu)型改變伴隨組蛋白乙?；腿?乙酰化，以調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄開關(guān)。DNA甲基化能引發(fā)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、 DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式 改變，從而控制基因表示。三、DNA甲基化經(jīng)過改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)抑制基因表示DNA甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄機(jī)制第31頁二、DNA甲基化檢測伎倆第32頁亞硫酸氫鹽測序原理第33頁1. 直接測序法第34頁1. 直接測序法第35頁 注： A：癌組織；B：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A43BE43B(369bp)43B2. 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序第36頁2.

11、 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測序第37頁3. 甲基化特異性PCR 第38頁3. 甲基化特異性PCR U M U M U M ladder100150200250MSP法檢測抑癌基因RASSF1A開啟子區(qū)甲基化圖 MSP檢測組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，U為非甲基化，M為甲基化。第39頁4. 結(jié)合重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶法第40頁5. 基于限制性內(nèi)切酶甲基化分析方法第41頁6. 基于親和純化甲基化分析方法第42頁三、DNA甲基化與癌癥第43頁DNA甲基化與癌癥DNA甲基化與癌癥發(fā)生發(fā)展有著親密聯(lián)絡(luò)，DNA甲基化改變包含高甲基化和去（低）甲基化。對不一樣腫瘤細(xì)胞D

12、NA分析表明，癌變細(xì)胞中出現(xiàn)基因突變概率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，與基因突變相比，DNA甲基化改變在細(xì)胞惡變過程中可能發(fā)揮了更大作用。第44頁DNA甲基化與癌癥發(fā)生發(fā)展有著親密聯(lián)絡(luò) 高甲基化抑癌基因緘默 低甲基化原癌基因被激活CpG島第45頁抑癌基因高甲基化在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因開啟子區(qū)域CpG島處于高甲基化狀態(tài)，因而抑癌基因緘默，使得細(xì)胞脫離正常細(xì)胞周期，進(jìn)入腫瘤發(fā)生過程。 原癌基因激活正常細(xì)胞中，因?yàn)榧谆饔迷┗蚨嗵幱诰}默狀態(tài)，但在各種腫瘤細(xì)胞中，均發(fā)覺原癌基因處于低甲基化狀態(tài)，而且低甲基化狀態(tài)與其蛋白表示升高親密相關(guān)，表明低甲基化狀態(tài)可使原癌基因激活。第46頁腫瘤細(xì)胞特征： 現(xiàn)在認(rèn)為，腫瘤細(xì)

13、胞含有以下特征:1.逃避細(xì)胞死亡(resisting cell death)2.對生長抑制信號不敏感( evading growth suppressors )3.誘導(dǎo)新血管生成(inducing angiogenesis)4.無限復(fù)制潛能(enablingreplicative immortality)5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移(activatinginvasion and metastasis)6.連續(xù)增殖信號(sustainingproliferative signaling) 另外，近年研究又提出了新兩點(diǎn):能量代謝改變(reprogramming of energymetabolism)和逃防

14、止疫系統(tǒng)破壞(evading immune destruction)以上幾點(diǎn)在細(xì)胞發(fā)生癌變過程中有著主要意義.近年來研究發(fā)覺，特定基因DNA高甲基化在這些過程中均發(fā)揮主要作用.第47頁1.逃避細(xì)胞死亡 通常情況下，細(xì)胞在接觸抑制、輻射、凋亡信號分子等刺激時(shí)會發(fā)生凋亡，不過癌細(xì)胞卻能夠不受凋亡控制，而大量分裂增殖.比如，p53基因是一個(gè)主要抑癌基因，能夠促使損傷細(xì)胞發(fā)生凋亡.50%癌癥中存在p53基因突變失活. p53基因編碼區(qū)甲基化狀態(tài)輕易因?yàn)槊摪被饔冒l(fā)生5mC-T轉(zhuǎn)換.同時(shí)，INK4a/ARF基因開啟子區(qū)域甲基化能夠使表示下降，造成原來受抑制MDM2表示上升，MDM2進(jìn)而結(jié)合p53并使后者

15、發(fā)生蛋白質(zhì)水平降解，使細(xì)胞逃避p53引發(fā)凋亡圈.DNA高甲基化與癌癥第48頁2.對生長抑制信號不敏感細(xì)胞生長抑制因子對細(xì)胞生長調(diào)控存在各種機(jī)制。在丙肝病毒感染肝細(xì)胞中，發(fā)覺了丙肝病毒關(guān)鍵蛋白(core protein)可引發(fā)p16基因開啟子甲基化，p16表示水平下降從而促進(jìn)了細(xì)胞分裂，在丙肝誘導(dǎo)肝癌中起著主要作用DNA高甲基化與癌癥第49頁3.誘導(dǎo)新血管生成新血管生成是癌癥發(fā)生中主要步驟.新血管生成首先需要金屬蛋白酶分解細(xì)胞外基質(zhì)，再經(jīng)過血管內(nèi)皮生長因子來誘導(dǎo)血管生成。組織金屬蛋白酶抑制劑能夠抑制金屬蛋白酶活性，同時(shí)與血管內(nèi)皮生長因子結(jié)合阻止血管生成。腫瘤細(xì)胞中組織金屬蛋白酶抑制劑下調(diào)有一部分

16、原因是因?yàn)殚_啟子區(qū)域甲基化引發(fā).血小管反應(yīng)蛋白（TSP1）是另一個(gè)抑制血管生成蛋白，TSP1基因開啟子區(qū)域甲基化引發(fā)基因表示抑制，進(jìn)而造成腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和血管生成.DNA高甲基化與癌癥第50頁4.無限復(fù)制潛能癌細(xì)胞無限復(fù)制潛能主要與端粒酶活性升高相關(guān)。端粒酶能夠利用RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，處理DNA復(fù)制時(shí)末端缺失問題。正常情況下端粒酶只有在受精卵和十細(xì)胞中才有活性，而腫瘤細(xì)胞大多含有高活性端粒酶。端粒酶主要組成部分是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶。它活性與端粒酶活性高度相關(guān). 引發(fā)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶激活開啟子甲基化有位置特異性，即與開啟子特定部位甲基化及相關(guān)區(qū)域整體非甲基化相關(guān)。DNA高甲基化與癌癥

17、第51頁5.組織浸潤和轉(zhuǎn)移組織浸潤和轉(zhuǎn)移是細(xì)胞惡變主要特征，近年來這力一面研究進(jìn)展快速.細(xì)胞骨架異常調(diào)整與腫瘤轉(zhuǎn)移親密相關(guān)。DFNAS是一個(gè)新發(fā)覺乳腺癌相關(guān)基因.DFNAS能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而DFNA基因開啟子甲基化后表示抑制造成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移幾率增大DNA高甲基化與癌癥第52頁6.連續(xù)增殖信號大部分癌細(xì)胞不需要外界生長刺激因子作用就能夠完成增殖，原因是細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了改變，造成促增殖因子作用增強(qiáng)。在結(jié)直腸癌中發(fā)覺腫瘤干細(xì)胞中SFRPs開啟子區(qū)域高甲基化使其表示抑制，引發(fā)了Wnt通路過分激活而刺激細(xì)胞分裂，因而細(xì)胞在不需要外界生長刺激因子作用下就能夠不停增殖。DNA高甲基化與癌癥第53

18、頁與癌癥發(fā)生過程中DNA甲基化不一樣，DNA低甲基化既包含特定基因(主要是原癌基因)低甲基化，還包含基因組范圍內(nèi)以非編碼重復(fù)序列為主DNA整體水平低甲基化.DNA低甲基化與癌癥第54頁1. 特定基因甲基化水平降低CT ( cancer/testis antigen genes)抗原屬于MACE ( melanoma and germ cell expressed)基因家族，正常情況下只在生殖細(xì)胞表示。CT抗原在各種腫瘤組織中高表示，如肺癌，胰腺癌，胃癌等。CT激活與它開啟子區(qū)域去甲基化相關(guān)。近年來，白血病基因，乳腺癌基因，結(jié)腸直腸癌，腎細(xì)胞癌基因肝癌基因中都發(fā)覺了由開啟子低甲基化所引發(fā)腫瘤相關(guān)

19、基因過表示.DNA低甲基化與癌癥第55頁2.基因組范圍整體DNA甲基化降低基因組范圍DNA甲基化程度能夠經(jīng)過甲基化敏感DNA酶來檢測。在各種癌癥當(dāng)中都發(fā)覺了基因組范圍整體水平DNA甲基化降低，包含許多重復(fù)序列甲基化水平下降。正常組織細(xì)胞甲基胞嘧啶含量約4%，而癌細(xì)胞則為大約2%一3%。DNA甲基化水平降低能夠出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生早期階段。腫瘤細(xì)胞在基因缺乏區(qū)域(gene-poor areas)DNA甲基化水平顯著下降，而基因開啟子區(qū)域甲基化差異則相對較小，提醒這些非編碼區(qū)域甲基化水平降低可能與腫瘤發(fā)生有更親密關(guān)系.DNA低甲基化與癌癥第56頁DNA甲基化與癌癥診療表觀遺傳學(xué)改變是細(xì)胞癌變主要特征之一

20、，所以，細(xì)胞DNA甲基化改變能夠作為癌癥早期診療主要依據(jù)。甲基化生物標(biāo)識不停發(fā)覺使這一技術(shù)在臨床應(yīng)用成為可能。 甲基化特異PCR技術(shù)(methylation-specific PCR MSP)出現(xiàn)，使得細(xì)胞DNA甲基化水平檢測變得十分方便。DNA甲基化檢測穩(wěn)定性好，有組織特異性，易于檢測且其異常程度常與癌癥進(jìn)展相關(guān).所以，相對于傳統(tǒng)基因突變檢測有很大優(yōu)勢。在許多癌癥中都己經(jīng)發(fā)覺了癌癥相關(guān)基因甲基化水平改變，如外周血細(xì)胞DNA低甲基化與膀胱癌發(fā)生親密相關(guān)，伴隨全基因組甲基化圖譜繪制，相信會有更多甲基化生物標(biāo)識投入到臨床癌癥診療中。第57頁與基因突變不一樣，表觀遺傳學(xué)改變大都是可逆，所以，利用藥品來改變細(xì)胞表觀遺傳學(xué)狀態(tài)可能是治療癌癥一條新路徑。當(dāng)前甲基化酶抑制劑主要有zebularine和 5-ADC 。 5-ADC在試驗(yàn)中顯示了對骨髓增生癥、白血病和實(shí)體腫瘤都有顯著療效。Zebularine在小鼠腸癌模型中能夠顯著降低息肉數(shù)量。其它甲基化抑制劑如RG-108，EGCG等在試驗(yàn)中均表現(xiàn)出了對腫瘤抑制作用。DNA甲基化