干細(xì)胞的體外培養(yǎng)概述

1、干細(xì)胞體外培養(yǎng)第1頁(yè)一、干細(xì)胞概念干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類含有自我復(fù)制能力(self-renewing)多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它能夠分化成各種功效細(xì)胞。干細(xì)胞是一個(gè)未充分分化，尚不成熟細(xì)胞，含有再生各種組織器官和人體潛在功效，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬(wàn)用細(xì)胞”。 第2頁(yè)干細(xì)胞幾個(gè)主要特征含有自我更新能力與自我維持能力，能夠無(wú)限增殖分裂。干細(xì)胞一旦形成，在機(jī)體內(nèi)終生都含有自我更新能力，以維持本身數(shù)目標(biāo)恒定。既含有生理性更新能力，也含有對(duì)損傷或疾病造成反應(yīng)有修復(fù)能力，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。 干細(xì)胞維持自穩(wěn)性機(jī)制：對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂第3頁(yè) 4 干細(xì)胞對(duì)稱分裂和不對(duì)稱分裂對(duì)稱分裂 （s

2、ymmetry division）不對(duì)稱分裂 （asymmetry division）干細(xì)胞 分 化 細(xì) 胞 干細(xì)胞 分化細(xì)胞第4頁(yè)干細(xì)胞幾個(gè)主要特征干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；含有多向分化能力（多能性或全能性），即能夠分化發(fā)育成各種胚層組織細(xì)胞（ES細(xì)胞），或能夠分化成為本系統(tǒng)各譜系細(xì)胞（特定組織干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞）。第5頁(yè)干細(xì)胞幾個(gè)主要特征干細(xì)胞自我更新與分化需要特定微環(huán)境，也就是說(shuō)干細(xì)胞往哪一個(gè)方向分化，必須在該細(xì)胞生存特定微環(huán)境前提下進(jìn)行分化。已經(jīng)有很多試驗(yàn)表明，如將ES細(xì)胞種植入小鼠大腦內(nèi)，這些干細(xì)胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。在不一樣生長(zhǎng)因子刺激下干細(xì)胞可表現(xiàn)出不一樣分化潛能第6頁(yè)干細(xì)胞幾

3、個(gè)主要特征干細(xì)胞分裂產(chǎn)生子細(xì)胞只能有兩種命運(yùn)保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。第7頁(yè)二、干細(xì)胞分類1、按分化潛能大小來(lái)分類:全能干細(xì)胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成全部組織和器官干細(xì)胞，它含有形成完整個(gè)體分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞（ pluripotent stem cell ），含有分化出各種組 織細(xì)胞潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個(gè)體能力，發(fā)育 潛能受到一定限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞是經(jīng)典例 子，它可分化出最少十二種血細(xì)胞 。專能干細(xì)胞（ unipotent stem cell ），這類干細(xì)胞只能向 一個(gè)類型或親密相關(guān)兩種類型細(xì)胞分化，如上皮組織 基底層

4、干細(xì)胞、肌肉中成肌細(xì)胞等。第8頁(yè)2、依據(jù)起源來(lái)分: 起源于胚胎- 胚胎干細(xì)胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖細(xì)胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 起源于成體組織- 成體干細(xì)胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）第9頁(yè)胚胎干細(xì)胞指從著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（桑椹胚）或原始生殖細(xì)胞取得一個(gè)含有多潛能性、可發(fā)育成為各種細(xì)胞、同時(shí)可保持不分化狀態(tài)而連續(xù)生長(zhǎng)克隆細(xì)胞系。它能夠無(wú)限增殖并分化成為全身200各種細(xì)胞類型，深入形成機(jī)體全部組織、器官。為全能干細(xì)胞。 第10頁(yè)成體干細(xì)胞是成體組織內(nèi)含有自我更新及分化一個(gè)或一個(gè)以上子細(xì)胞未

5、成熟細(xì)胞。起源于成年組織或器官，普通含有組織特異性，只能分化成特定細(xì)胞或組織。為多能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞等。 第11頁(yè)3、依據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生名稱進(jìn)行分類:胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞第12頁(yè)三、干細(xì)胞研究歷史情況 1959年，美國(guó)首次報(bào)道了經(jīng)過(guò)體外受精（IVF）動(dòng)物。 60年代，幾個(gè)近親種系小鼠睪丸畸胎瘤研究表明其起源于胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cells, EG細(xì)胞）,此工作確立了胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）是一個(gè)干細(xì)胞。 1968年，Edwa

6、rds 和Bavister 在體外取得了第一個(gè)人卵子。 70年代，EC細(xì)胞注入小鼠胚泡產(chǎn)生雜合小鼠。培養(yǎng)EC細(xì)胞作為胚胎發(fā)育模型，即使其染色體數(shù)目屬于異常。1978年，第一個(gè)試管嬰兒在英國(guó)誕生。 第13頁(yè)1981年，從小鼠胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離出小鼠ES細(xì)胞，并建立了小鼠ES細(xì)胞體外培養(yǎng)條件。將ES細(xì)胞注入小鼠，能誘導(dǎo)形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人從人睪丸畸胎瘤細(xì)胞系Tera-2中產(chǎn)生出多能、可判定（克隆化）細(xì)胞，稱之為胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）?？寺∪薊C細(xì)胞在視黃酸作用下分化形成神經(jīng)元樣細(xì)胞和其它類型細(xì)胞。 1989年

7、，Pera 等分離了一個(gè)人EC細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生出三個(gè)胚層組織。這些細(xì)胞是非整倍體（比正常細(xì)胞染色體多或少），他們?cè)隗w外分化潛能是有限。 第14頁(yè)1998年美國(guó)有兩個(gè)小組分別培養(yǎng)出了人多能干細(xì)胞： James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)研究小組方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取 inner cell mass細(xì)胞，建立細(xì)胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)另一個(gè)研究小組方法是：從受精后59周人工流產(chǎn)胚胎中提取生殖母細(xì)胞( primordial germ cell )，建立細(xì)胞株。1999年12月，美國(guó)科學(xué)家在

8、美國(guó)科學(xué)院院刊匯報(bào)說(shuō)，小鼠肌肉組織成體干細(xì)胞能夠“橫向分化”為血液細(xì)胞。隨即，世界各國(guó)科學(xué)家相繼證實(shí)，成體干細(xì)胞，包含人類成體干細(xì)胞含有可塑性。1999年12月，干細(xì)胞研究進(jìn)展被科學(xué)雜志評(píng)選為該年度世界十大科學(xué)進(jìn)展之首。日本Yamanaka研究小組和美國(guó)James Thomson 研究小組分別取得誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cell，iPS細(xì)胞）。 第15頁(yè)至今已分離得到胚胎干細(xì)胞物種有：小鼠胚胎干細(xì)胞（1981）金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。分離得到人胚胎干細(xì)胞（

9、1998），胚胎生殖細(xì)胞（1998），當(dāng)前不停報(bào)道成年組織起源干細(xì)胞。第16頁(yè)四、胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)（一）技術(shù)原理基本標(biāo)準(zhǔn)：促進(jìn)ES增殖同時(shí)，維持其未分化二倍體狀態(tài)。有喂養(yǎng)層（feeder layer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥(niǎo)嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制備喂養(yǎng)細(xì)胞單層，主要是利用其分泌生長(zhǎng)因子FGF和抑制干細(xì)胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細(xì)胞在體外克隆而不分化。無(wú)喂養(yǎng)層培養(yǎng)法：利用各種能分泌抑制分化因子細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組LIF制備條件培養(yǎng)基。第17頁(yè)（二）

10、基本過(guò)程喂養(yǎng)層細(xì)胞制備或條件培養(yǎng)基制備胚胎制備和培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞分離胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞判定凍存與復(fù)蘇細(xì)胞克隆形態(tài)堿性磷酸酶檢測(cè)核型判定分化能力觀察嵌合能力測(cè)定第18頁(yè)1、喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ MEF）：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分散細(xì)胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細(xì)胞作為喂養(yǎng)層細(xì)胞。STO細(xì)胞：按照普通已建細(xì)胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采取胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時(shí)復(fù)蘇。第19頁(yè) MEF和STO優(yōu)缺點(diǎn)：MEF分泌促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖和抑制分化因子能力比STO強(qiáng)，STO作喂養(yǎng)細(xì)胞時(shí)常需在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長(zhǎng)久

11、傳代，需經(jīng)常準(zhǔn)備懷孕小鼠制備第三代至第五代細(xì)胞，STO則可長(zhǎng)久傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外源性基因胚胎干細(xì)胞篩選取。SNL細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因STO細(xì)胞，可分泌足夠抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞篩選。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，死亡MEF或STO染色體可能造成胚胎干細(xì)胞突變及影響正常核型保持。不易取得純胚胎干細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余絲裂霉素C會(huì)影響胚胎干細(xì)胞增殖。第20頁(yè)報(bào)道人源性滋養(yǎng)層細(xì)胞：人骨髓起源間充質(zhì)干細(xì)胞胎兒肌肉或胎兒皮膚細(xì)胞新生兒包皮成纖維細(xì)胞成人子宮內(nèi)膜細(xì)胞人胎盤(pán)成纖維

12、細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)分化獲取間充質(zhì)干細(xì)胞第21頁(yè)2、喂養(yǎng)單層制備MEF或STO連成一片，以含10g/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3 h（如細(xì)胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次， 射線處理者不用清洗。消化細(xì)胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過(guò)（0.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）培養(yǎng)瓶，種植細(xì)胞數(shù)：MEF7.5104-105個(gè)/cm2，STO為5104個(gè)/cm2。培養(yǎng)至細(xì)胞連成一片沒(méi)有間隙（中間可補(bǔ)加處理過(guò)細(xì)胞），制備好喂養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細(xì)胞培養(yǎng)液。第22頁(yè)觀察：好喂養(yǎng)單

13、層，細(xì)胞連成一片，無(wú)間隙，死亡細(xì)胞和雜細(xì)胞極少。MEF和STO產(chǎn)生抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細(xì)胞外基質(zhì)上。無(wú)間隙喂養(yǎng)單層確保了胚胎干細(xì)胞都能與喂養(yǎng)層細(xì)胞接觸而到達(dá)最正確效果。第23頁(yè)3、用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞條件培養(yǎng)基直接在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細(xì)胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細(xì)胞分化因子DIF。搜集培養(yǎng)72h培養(yǎng)液，過(guò)濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年紀(jì) 2-3周大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分泌抑制胚胎干細(xì)胞分化因子。搜集1-6

14、代細(xì)胞培養(yǎng)液，過(guò)濾除菌，用前6份+3份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。第24頁(yè)4、胚胎干細(xì)胞分離和培養(yǎng)（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細(xì)菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有利于囊胚貼壁、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)增殖及胚胎干細(xì)胞集落形成。使用前還要添加-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（ 0.15mmol/L）：保護(hù)細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中巰基不被氧化，促進(jìn)胚胎干細(xì)胞貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點(diǎn)。第25頁(yè)血清缺點(diǎn)：成份復(fù)雜，不利于整合到胚胎干細(xì)胞基因組中外源性基因功效測(cè)定；可能含有一些未知促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化

15、因子；含有微量血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)。無(wú)血清胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液無(wú)上述缺點(diǎn)，但細(xì)胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。第26頁(yè)（2）胚胎干細(xì)胞分離小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細(xì)胞，取得內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass，ICM），并分散為3-4個(gè)細(xì)胞在一起細(xì)胞團(tuán)第27頁(yè)人胚胎干細(xì)胞起源 a.自終止妊娠（5-9周人工流產(chǎn)）胎兒中提取生殖母細(xì)胞( primor

16、dial germ cell )。 28 Gearhart法第28頁(yè)29 b.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細(xì)胞。用這種方法，每個(gè)胚胎可取得1520個(gè)細(xì)胞用于培養(yǎng)。 Thomson法第29頁(yè)c.經(jīng)過(guò)體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（SCNT技術(shù)）獲取30 第30頁(yè)其它干細(xì)胞分離與純化 干細(xì)胞表面有許多特殊標(biāo)識(shí)，以造血系統(tǒng)為例，干細(xì)胞表面標(biāo)志有Sca-1和c-kit等。另外各種成體干細(xì)胞還有各自獨(dú)特標(biāo)識(shí)物，如人造血干細(xì)胞表現(xiàn)為CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆為陰性另外干細(xì)胞還有不一樣于普通分化細(xì)胞物理特征，比如干細(xì)胞不被染料Hoechst33324和Rhodam

17、ine123染色。利用這些特征及表面標(biāo)志，采取熒光細(xì)胞分離器從單細(xì)胞懸液中即可分離純化干細(xì)胞。 第31頁(yè)（3）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)有喂養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)：將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)吸置處理過(guò)喂養(yǎng)層上，一個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)放置一個(gè)孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時(shí)，消化30s后棄消化液，殘余消化液繼續(xù)作用，當(dāng)喂養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細(xì)胞之間分開(kāi)），終止消化，普通為2-3min加適量培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，接種新喂養(yǎng)層擴(kuò)大培養(yǎng)。無(wú)喂養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細(xì)胞：將已培養(yǎng)2-3d生長(zhǎng)旺盛干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，添加新培養(yǎng)液，按照1：3或1

18、：6百分比轉(zhuǎn)鐘。第32頁(yè)注意事項(xiàng)：最初分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以3-4個(gè)細(xì)胞團(tuán)為宜，但集落形成后，傳代過(guò)程中一定要消化成單細(xì)胞，不然胚胎干細(xì)胞會(huì)相互誘導(dǎo)，易于分化。培養(yǎng)條件要一直如一。為了增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞粘附力，除明膠包被外，還能夠用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進(jìn)粘附。第33頁(yè)（4）培養(yǎng)結(jié)果hES細(xì)胞集落（10）胚胎干細(xì)胞呈集落狀（島嶼狀）生長(zhǎng)，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長(zhǎng)，細(xì)胞之間界限不清。消化成單細(xì)胞后細(xì)胞小而圓，核大，胞漿小。第34頁(yè)A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell第35頁(yè)A cultur

19、e dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.第36頁(yè)5、胚胎干細(xì)胞凍存和復(fù)蘇凍存液：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO。凍存細(xì)胞密度：106-107個(gè)/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細(xì)胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，依然用不含LIF胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液凍存。第37頁(yè)（三）胚胎干細(xì)胞判定1、 ES細(xì)胞生

20、物學(xué)特征（1）ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細(xì)胞含有與早期胚胎細(xì)胞相同形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個(gè)或幾個(gè)核仁。細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其極難發(fā)育分化形成動(dòng)物個(gè)體。 第38頁(yè)（2）ES細(xì)胞生長(zhǎng)特征ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥(niǎo)巢，細(xì)胞界限不清，克隆周?chē)袝r(shí)可見(jiàn)單個(gè)ES細(xì)胞和分化扁平狀上皮細(xì)胞。 ES細(xì)胞增殖快速，每1824 h分裂增殖 1次。另外，其還能夠在體外進(jìn)行選擇、操作、凍存。凍存細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特征，而且來(lái)自一個(gè)克隆細(xì)胞

21、含有一樣特征。第39頁(yè)40 人胚胎干細(xì)胞(hES)特點(diǎn) 形態(tài)：圓形或橢圓，體積較小，核質(zhì)比較大，體外抑制分化培養(yǎng)時(shí)呈鳥(niǎo)巢狀，集落生長(zhǎng)并緊密堆積，細(xì)胞界限不顯著。第40頁(yè) （3）ES細(xì)胞高度分化潛能 ES細(xì)胞在體外需在喂養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分 化狀態(tài)，一旦脫離喂養(yǎng)層就自發(fā)地進(jìn)行分化。在單層培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞自發(fā)分化成各種細(xì)胞， 懸浮培養(yǎng)中： “簡(jiǎn)單類胚體” “囊狀胚體” 細(xì)胞分化物。ES細(xì)胞可進(jìn)行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90以上ES細(xì)胞 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， *聚集培養(yǎng)ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 心肌細(xì)胞。 *將ES細(xì)胞注射到同源動(dòng)物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞 組

22、成可代表3個(gè)胚層細(xì)胞。 *用ES細(xì)胞作核供體進(jìn)行細(xì)胞核移植，能夠得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動(dòng)物個(gè)體。第41頁(yè) （4）堿性磷酸酶表示 許多資料表明，小鼠、大鼠桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞都有堿性磷酸酶（AKP）表示，小鼠EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富AKP。而在已分化EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽(yáng)性或陰性。豬、兔桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽(yáng)性。所以，AKP慣用來(lái)作為判定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化是否標(biāo)志之一。第42頁(yè) （5）胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原表示 早期胚胎細(xì)胞表面均表示胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞表面均可檢測(cè)到SSEA-1表示。小鼠SSEA

23、-1表示自8細(xì)胞期開(kāi)始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部呈強(qiáng)陽(yáng)性，晚期囊胚中部分ICM呈強(qiáng)陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分為陰性。所以，SSEA也常作為ES細(xì)胞判定一個(gè)標(biāo)志。第43頁(yè) 2、ES細(xì)胞全能性主要表達(dá)在以下幾方面： 形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動(dòng)物皮下可形成畸胎瘤，包含三個(gè)胚層細(xì)胞； 形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長(zhǎng)，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個(gè)與畸胎瘤相同各種細(xì)胞系混雜集合體、含有三個(gè)胚層組織； 第44頁(yè) 直系分化。經(jīng)過(guò)控制ES細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，或遺傳操縱特定基因表示，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，比如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和Neu

24、roD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞； 形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動(dòng)物囊胚腔中后，能夠形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞能夠參加嵌合體各個(gè)器官包含生殖腺發(fā)育。這是檢驗(yàn)一個(gè)細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。 第45頁(yè)3、ES細(xì)胞判定- 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)- 核型分析- 堿性磷酸酶（AKP）染色- SSEA-I 免疫熒光標(biāo)識(shí)- 分化能力檢測(cè) 體外分化試驗(yàn) 體內(nèi)分化試驗(yàn) 嵌合體形成試驗(yàn) 核移植試驗(yàn)第46頁(yè) （1）ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)判定 依ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁）和生長(zhǎng)特征（呈克隆狀生長(zhǎng)，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥(niǎo)巢，界限不清）對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行初步判定。第47頁(yè) （2）核型分析 E

25、S細(xì)胞含有正常二倍體核型，可用核型分析進(jìn)行檢驗(yàn)第48頁(yè) （3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而展現(xiàn)顏色。步驟：生長(zhǎng)胚胎干細(xì)胞克隆蓋片以無(wú)水乙醇或冷丙酮固定10-15min水洗滴加孵育液室溫5-10min水洗10min復(fù)染（甲基綠等） 10min。結(jié)果：未分化胚胎干細(xì)胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。對(duì)照：以已建系ES細(xì)胞（或小鼠脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽(yáng)性對(duì)照，作用液中不含-萘酚磷酸鈉為陰性對(duì)照。 第49頁(yè)第50頁(yè)（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原表示免疫熒光檢測(cè)SSEA

26、胚胎階段特異性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分離hES 陰性 弱陽(yáng)性 強(qiáng)陽(yáng)性Gearhart分離hES 陽(yáng)性 弱陽(yáng)性 陽(yáng)性小鼠ES 陽(yáng)性 陰性 陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表示表面抗原有種屬差異。RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Oct-4表示 Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表示。人和小鼠胚胎干細(xì)胞都表示轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，其表示能力大大降低。第51頁(yè)52第52頁(yè)（5）分化能力檢測(cè)體外分化能力觀察:無(wú)喂養(yǎng)層和無(wú)抑制分化因子條件下培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞會(huì)分化成各種細(xì)胞或發(fā)育成胚胎體：3d “簡(jiǎn)單類胚體” 5-10d“囊狀胚體” 貼壁細(xì)胞為細(xì)胞分化物。第53頁(yè)體內(nèi)分化能

27、力觀察：ES細(xì)胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個(gè)細(xì)胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個(gè)細(xì)胞）約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周深入增大，摘除腫塊固定切片染色：見(jiàn)三個(gè)胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細(xì)胞和組織移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤第54頁(yè)嵌合能力測(cè)定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠）著床前胚胎內(nèi)，或未起源于白化體小鼠ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個(gè)體。 如ES含有嵌合能力，則會(huì)融合到宿主胚胎細(xì)胞中，并共同發(fā)育形成各種組織細(xì)胞并產(chǎn)生個(gè)體小鼠即為嵌合體

28、，其毛色應(yīng)是ES細(xì)胞起源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色觀察，也可檢測(cè)同工酶遺傳標(biāo)識(shí)，或采取PCR和小衛(wèi)星DNA方法等判定嵌合體。第55頁(yè)六、成體干細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)獲取相對(duì)輕易 源于患者本身成體干細(xì)胞在應(yīng)用時(shí)不存在組織相容性問(wèn)題，防止了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑 理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險(xiǎn)很低，而且所受倫理學(xué)爭(zhēng)議較少 成體干細(xì)胞還含有多向分化潛能 第56頁(yè)但胚胎干細(xì)胞也存在本身優(yōu)勢(shì)： 胚胎干細(xì)胞能永生化，能夠傳代建系，且增殖能力強(qiáng)，起源充沛。 即使成體干細(xì)胞含有向多系分化能力，但這種分化“效率”尚不理想。經(jīng)過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)能提升轉(zhuǎn)化效率，不過(guò)體外轉(zhuǎn)化是否會(huì)引發(fā)

29、成體干細(xì)胞遺傳改變還有待證實(shí)，而且這種分化是否是成體干細(xì)胞多系分化結(jié)果尚無(wú)法必定。成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞各有本身優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。同時(shí)開(kāi)展對(duì)二者研究，能互為裨益，相得益彰。二者研究對(duì)干細(xì)胞領(lǐng)域而言都是必要。 第57頁(yè)成體干細(xì)胞判定方法：科學(xué)家還未就成體干細(xì)胞判定標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成一致，經(jīng)常被采取判定方法包含： 利用分子標(biāo)識(shí)在活體組織中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)識(shí)，然后確定它們所產(chǎn)生特定細(xì)胞類型。 將細(xì)胞從活體動(dòng)物上分離出來(lái)，在對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行標(biāo)識(shí)，之后將細(xì)胞移植入另一個(gè)動(dòng)物體內(nèi)，觀察該細(xì)胞是否能夠再生其起源組織。 分離細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并對(duì)其分化進(jìn)行控制，通常采取加入生長(zhǎng)因子或向細(xì)胞內(nèi)引入新基因方法，進(jìn)而觀察細(xì)

30、胞分化方向。 第58頁(yè) 當(dāng)前研究成體干細(xì)胞 （Adult Stem Cells）Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells 第59頁(yè)造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究與應(yīng)用突破口1. 造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化最正確模型。2. 造血干祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞表面標(biāo)志較為清 楚，細(xì)胞表型特征可進(jìn)行定量分析，且可分選。3. 造血干細(xì)胞增殖及向各系分化主要誘導(dǎo)因 子

31、、受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等原因較為清楚。4. 造血細(xì)胞發(fā)揮功效可相對(duì)游離，不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜“下游”工藝，因 此便于直接應(yīng)用于臨床。第60頁(yè)神經(jīng)干細(xì)胞(nural stem cell，NSC) NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)三種基本細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 神經(jīng)干細(xì)胞生化標(biāo)識(shí)為巢素蛋白及波形蛋白。因?yàn)榉蛛x神經(jīng)干細(xì)胞所需胎兒腦組織較難取材，神經(jīng)干細(xì)胞研究仍處于初級(jí)階段。 第61頁(yè)五、當(dāng)前干細(xì)胞研究熱點(diǎn)人體干細(xì)胞建株；干細(xì)胞保持不分化培養(yǎng)；干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化；干細(xì)胞應(yīng)用法律、倫理道德問(wèn)題；干細(xì)胞、組織工程、器官工程；胚胎組織種植及定向誘導(dǎo)分化。第62頁(yè)

32、 六、胚胎干細(xì)胞研究應(yīng)用前景ES細(xì)胞在哺乳動(dòng)物個(gè)體發(fā)生發(fā)育規(guī)律研究中極有價(jià)值工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化理想伎倆；ES細(xì)胞是研究基因功效首選細(xì)胞；ES細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物主要路徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引發(fā)一場(chǎng)醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機(jī)理和新藥品篩選。第63頁(yè) Human Disease modelHepatocytesBlood Cells藥品開(kāi)發(fā)、毒性測(cè)試臨床醫(yī)療應(yīng)用基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究Human disease model胚胎干細(xì)胞基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用第64頁(yè)起源于干細(xì)胞組織可能用于治療疾病 細(xì)胞類型 治療疾病神經(jīng)細(xì)胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素細(xì)胞 糖尿病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞