單雙波長的使用

1、單雙波長的使用第1頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二概念波長：是在空間或者沿著導(dǎo)線傳輸?shù)囊粋€(gè)波形信號(hào)中，相鄰周期且同樣端點(diǎn)之間的距離。 單波長：就是使用一種對(duì)顯色具有最大吸收的波長即450或492進(jìn)行比色測定。雙波長：除了用對(duì)顯色具有最大吸收的波長外，同時(shí)對(duì)特異性顯色不敏感的波長如630nm進(jìn)行測定。 第2頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二第3頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題一問：酶標(biāo)儀常用波長有那些？答：不同型號(hào)的酶標(biāo)儀安裝的濾光片不一樣。如：BIO-RAD-550 標(biāo)準(zhǔn)波長：405、450、490、655 也可選用40

2、0700nm MK3標(biāo)準(zhǔn)波長：405、450、492、630也可選用340750nm結(jié)合工作中實(shí)際情況合理的選擇酶標(biāo)儀型號(hào)第4頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題二問：為什么試驗(yàn)中的常用波長是450或492nm，少部分是405,而不是其他的波長？答：1.了解 市場 2.特定波長：在特定條件下測定每一種物質(zhì)都有其特定的波長，在此波長下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段，就會(huì)造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測定檢測物時(shí)，我們選擇特定的波長進(jìn)行檢測，稱為測量波長 第5頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題二 3.學(xué)習(xí)兩個(gè)原理 3.1.TMB

3、 DAB+聯(lián)苯醌（在450nm處有最大的消光系數(shù)）So:ELISA中，底物反應(yīng)顯色后，常選擇其具最大吸收的波長450比色測定結(jié)果。 3.2. pNPP pNP（在405nm處有最大的消光系數(shù)）HRPH2O2AP第6頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題三問：為什么有的波長需要添加一個(gè)副波長？而且常用的是630nm？答：1.Madersbacher和Berger做了個(gè)實(shí)驗(yàn) 首先是用450和405測定一系列的已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)本品，證實(shí)450/405Z之比為3.2;其次用405測定很低濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值再乘以常熟3.2，即為待測樣本在波長450的值。第7頁，共17頁，2022年

4、，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題三證明：雙波長測定可以提高ELISA的敏感度。2.每一種物質(zhì)對(duì)光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，我們再選取一個(gè)參照波長，以消除這個(gè)不準(zhǔn)確性。在參照波長下，檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。3.630nm下得到的吸光度是非特異性，主要來時(shí)于板塊上諸如指紋、灰塵，贓物等所致的吸收。 第8頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題四問：雙波長測定時(shí)OD結(jié)果是如何計(jì)算得出的？答：樣本值=敏感值-非敏感值敏感波上下 的吸光度測定值為樣本測定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟

5、物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶 反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測得的吸光度即為臟物的吸光度值。 第9頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二實(shí)驗(yàn)分析1第10頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題五問:單波長測定的干擾因素有那些？答：1.內(nèi)源性干擾包括噪音、漂移、電壓等 2.表面張力的影響 3.重復(fù)性差第11頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二問題六問:雙波長測定的優(yōu)點(diǎn)？1.一般不必設(shè)空白孔 。仍設(shè)空白孔，就可能會(huì)出現(xiàn)負(fù)值。2. 能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異

6、顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。3.重復(fù)性好。第12頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二實(shí)驗(yàn)分析2刮花前刮花前刮花后刮花后第13頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二總結(jié) 現(xiàn)象：1.單雙的結(jié)果差異比較大 2.刮花對(duì)雙波長的影響比較的小 討論： 結(jié)論：運(yùn)用雙波長不會(huì)影響靈敏度，反而會(huì)減少其他因素的干擾。建議酶免法測定使用雙波長，這樣可以提高臨界值附近樣本結(jié)果判斷的準(zhǔn)確度，減少實(shí)驗(yàn)誤差。第14頁，共17頁，2022年，5月20日，2點(diǎn)14分，星期二波長選擇原理1.首先要確定顯色液的最大吸收峰 聯(lián)苯聯(lián)苯醌 ： 450nm 甲苯、二甲苯：465nm 硝基酚 ：405nm2.結(jié)合試劑說明書選擇波長 用酶標(biāo)儀單波長450nm或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值（用單波長測定時(shí)需用空白對(duì)照孔調(diào)零），并記錄結(jié)果。第15頁，共17頁，2022年，5月20