生長激素基礎(chǔ)知識(shí),上海

1、生長激素基礎(chǔ)知識(shí),上海主要內(nèi)容生長激素的概述生長激素的生物學(xué)特性生長激素結(jié)構(gòu)生長激素分泌調(diào)節(jié)生長激素的分泌特點(diǎn)生長激素分泌的影響因素生長激素分泌的調(diào)節(jié)生長激素的生理作用、作用機(jī)制一、生長激素概述生長激素的生物學(xué)特性生長激素結(jié)構(gòu)GH生物學(xué)特性人生長激素（hGH）：垂體前葉（腺垂體）嗜酸細(xì)胞分泌的、由191個(gè)AA組成的非糖化多肽。腺垂體中含量最多的激素,約占腺垂體激素的50% 。人類GH基因簇是一組多基因家族hGH基因（hGH-1和hGH-2）hGH-1為正常的hGH基因，主要在垂體的生長激素細(xì)胞中表達(dá)； hGH-2是一個(gè)變異基因，幾乎只在胎盤中表達(dá)；病理情況下， hGH-2基因可在垂體瘤組織中表

2、達(dá)。絨毛膜促生長泌乳素基因（hCS-A、 hCS-B和hCS-C）GH生物學(xué)特性垂體和循環(huán)中hGH 的分子是非均一的，包括單體、單體聚合體、分子片段和單體與其它蛋白的復(fù)合物。hGH的分子量20 KD：約占垂體和循環(huán)中hGH的510，對糖代謝影響較小，對促生長、IGF生成和生乳作用于22KD的單體相似，但與hGH受體親和力較弱。22 KD ：是主要的hGH單體的分子形式，約占垂體內(nèi)hGH的7075，也是循環(huán)中主要的hGH （約占43左右）。 25 KD：hGH-2基因的翻譯產(chǎn)物，可發(fā)生糖基化，故分子量增加。GH的一級(jí)結(jié)構(gòu)二硫鍵GH的天然構(gòu)象第一張hGH晶體衍射照片SCIENCE，1992；255

3、：306-312二、GH分泌調(diào)節(jié)生長激素的分泌特點(diǎn)生長激素分泌的影響因素生長激素分泌的調(diào)節(jié)GH的分泌特點(diǎn)脈沖式分泌GH以脈沖形式分泌，晝夜波動(dòng)大，在分泌低峰時(shí),血循環(huán)中難測到。一般GH分泌頻率夜間比白天多，青春期前和青春期24h內(nèi)約有68次脈沖數(shù), 約每34小時(shí)1次。青春發(fā)育中期分泌脈沖幅度最大，分泌量最多。24h內(nèi)脈沖數(shù)和振幅與年齡相關(guān)。晝夜節(jié)律正常人入睡后1小時(shí)（4590min）左右分泌達(dá)高峰，分泌量是1天總量的一半以上。如睡眠時(shí)間變化，GH峰值出現(xiàn)時(shí)間也相應(yīng)變化。重點(diǎn)間隔34小時(shí)* ，約68個(gè)脈沖/日，夜間最高生理情況下GH的分泌模式各年齡階段垂體GH的分泌青春前期青春期成人早中后年齡（

4、歲）9.00.311.5 0.214.4 0.216.4 0.423.0 0.624hGH濃度(ug/L)6.7 1.04.7 0.713.8 2.44.4 0.93.9 0.5GH脈沖強(qiáng)度(ug/L)14.4 1.312.8 1.322.4 2.814.7 3.910.3 1.3GH脈沖數(shù)(24h)8.8 0.77.0 0.57.8 0.66.60.66.1 0.5GH分泌(ugkg-1 24h-1)2920601917GH分泌的影響因素運(yùn)動(dòng)的影響正常人在基礎(chǔ)代謝狀態(tài)下，血清GH常測不到，劇烈運(yùn)動(dòng)后可引起GH明顯升高。運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)已作為兒童GHD的篩選實(shí)驗(yàn)。應(yīng)激狀態(tài)的影響大多數(shù)應(yīng)激狀態(tài)下可引起G

5、H分泌（外科手術(shù)、創(chuàng)傷、麻醉、穿刺、精神緊張和焦慮）。兒童在心理不適宜的環(huán)境下可出現(xiàn)可逆性GH分泌抑制;代謝物質(zhì)的影響急性低血糖是刺激GH分泌的強(qiáng)烈因素，高血糖抑制GH分泌。高蛋白飲食或口服、靜滴精氨酸、亮氨酸等可刺激GH分泌。高血糖和游離脂肪酸水平升高可抑制GH分泌。重點(diǎn)調(diào)節(jié)GH分泌的體內(nèi)外因素及藥物興奮抑制生理睡眠、運(yùn)動(dòng)、物理應(yīng)激心理應(yīng)激血氨基酸升高、低血糖血糖升高、脂肪酸升高藥理胰島素（誘導(dǎo)低血糖）糖皮質(zhì)激素ACTH、MSH、E2血管緊張素5-羥色胺拮抗劑胃腸及下丘腦激素多巴胺拮抗劑（吩噻嗪）r-氨基丁酸拮抗劑-腎上腺素能促效劑（異丙腎）5-羥色胺、多巴胺促效劑-腎上腺素能拮抗劑（酚妥拉

6、明）-腎上腺素能拮抗劑膽堿能拮抗劑（丙咪嗪）-腎上腺素能促效劑（可樂寧）病理饑餓、蛋白質(zhì)營養(yǎng)缺乏甲狀腺功能減退肥胖GH分泌的調(diào)節(jié)下丘腦激素調(diào)節(jié)生長激素釋放激素（GHRH）：是腺垂體分泌和合成GH的最主要的生理刺激物，呈脈沖式釋放。GH對GHRH合成有反饋性抑制作用。生長激素釋放抑制激素（SS）：除了抑制GH的基礎(chǔ)分泌，還抑制GH對生理性和藥理性刺激，也抑制病理情況下的GH異常升高。神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)來源于體內(nèi)外環(huán)境的各種刺激通過神經(jīng)遞質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過多巴胺，5-羥色胺和去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)GH的分泌。高級(jí)神經(jīng)中樞下丘腦垂體前葉GHGHRH(+)SRIF(-)IGFs(亦稱生長

7、介素)直接作用三、GH的生理作用、作用機(jī)制生理作用：促進(jìn)生長，調(diào)節(jié)骨代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝其他作用作用機(jī)制生長激素受體（GHR）和生長激素結(jié)合蛋白（GHBP）胰島素樣生長因子（IGFs）GH生理作用（一）促進(jìn)生長，調(diào)節(jié)骨代謝刺激骨骺端軟骨細(xì)胞分化、增殖，從而促進(jìn)骨生長，使骨長度增加?？芍苯哟碳こ晒羌?xì)胞代謝，并對維持骨礦物質(zhì)含量、骨密度起重要作用。協(xié)同性激素及促鈣化激素共同干預(yù)骨的重塑。重點(diǎn)GH生理作用（二）調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，糾正負(fù)氮平衡。調(diào)節(jié)脂代謝，降低機(jī)體脂肪儲(chǔ)備，增加血清脂肪酸含量，降低血清膽固醇和低密度脂蛋白水平?？山档图?xì)胞對胰島素的敏感性，減少外周組織對葡萄糖利用，使血糖升高。對水

8、、礦物質(zhì)代謝有重要作用?？墒辜?xì)胞內(nèi)鉀鹽、磷酸鹽潴留，還可促進(jìn)腎小管鈉回吸收，引起水、鈉潴留。重點(diǎn)GH生理作用（三）其他作用增加機(jī)體免疫力，刺激免疫球蛋白合成，促進(jìn)巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖。加速傷口愈合，刺激燒傷創(chuàng)面及手術(shù)切口成纖維細(xì)胞合成膠原。促進(jìn)心肌蛋白合成，增加心肌收縮力，降低心肌耗氧量。GH具有抗衰老,促進(jìn)腦功能效應(yīng);促進(jìn)精子形成、排卵等重點(diǎn)GH的作用機(jī)制（一）生長激素受體（GHR）和生長激素結(jié)合蛋白（GHBP）GHR是由620個(gè)AA組成的跨膜糖蛋白，包括胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域。2個(gè)GHR形成同源二聚體，分別與1個(gè)GH分子上的2個(gè)不同位點(diǎn)結(jié)合，結(jié)合后受體的胞內(nèi)部分與細(xì)胞質(zhì)中JAK酪氨酸家族

9、結(jié)合，使受體羧基端酪氨酸磷酸化，從而傳遞信號(hào)，發(fā)揮生物效應(yīng)。GHBP是膜受體的片段，可與GHR競爭與GH結(jié)合，所以GHBP可抑制過高的GH結(jié)合到組織受體上。重點(diǎn)JAK2JAK2PPGH細(xì)胞膜GH 受體GH的作用機(jī)制（二）胰島素樣生長因子（IGFs）GH對靶組織發(fā)揮效應(yīng)，除了直接作用外，還通過IGFs的介導(dǎo)，尤其是對長骨的促生長作用。現(xiàn)知有生物作用的IGF分為兩類IGF-1：堿性多肽，有強(qiáng)的促生長作用；IGF-2：中性肽，有強(qiáng)的胰島素樣活性，是胚胎生長、發(fā)育的調(diào)節(jié)因子。合成IGF的部位極為廣泛，幾乎遍布體內(nèi)所有組織，其主要合成部位在肝臟，其次是腎臟、骨骼肌等組織。其他許多組織局部也可合成，它們均

10、接受GH的刺激，多數(shù)組織產(chǎn)生的IGF并不釋放入血液，常通過旁分泌和自分泌的方式發(fā)揮作用。 垂體 肝 臟 局 部 直接作用，不依賴IGF-I 線性生長 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路三聚體（循環(huán)）重點(diǎn)總結(jié)生長激素的分泌特點(diǎn)生長激素分泌的影響因素生長激素分泌的調(diào)節(jié)生長激素的生理作用、作用機(jī)制藥用GH發(fā)展史1993-, E. Coli 分泌型表達(dá)技術(shù)和蛋白質(zhì)水相穩(wěn)定技術(shù)相結(jié)合1987-, E. Coli 和小鼠C127細(xì)胞分泌型表達(dá)技術(shù)1985-2004, E. Coli 包涵體技術(shù)1958-1985, 人垂體中提取人垂體源性GH(somatotropin)192AA-rhGH (somatrem)191AA-

11、rhGH (somatropin，粉劑)191AA-rhGH (somatropin，水劑)1999-, PLGA微球緩釋技術(shù)的應(yīng)用長效 rhGH 粉劑長效 rhGH 水劑2007-, PEG 化學(xué)修飾等長效技術(shù)的應(yīng)用人垂體源性 hGH (somatotropin)1958年，Raben 首次從人垂體中成功提取hGH，Kabi 公司進(jìn)行商業(yè)性銷售 缺點(diǎn): 因來源受限，產(chǎn)量稀少因含人類多種分子量的GH（主要是22 kDa，20 kDa，也有少量5KD），22 kDa占垂體hGH的7075%，20 kDa占510%（其與受體親和力較弱），所以產(chǎn)品中22 kDa的GH含量并非100%，相對純度較低1

12、 * 易受hGH 供體病毒污染 因不斷報(bào)道因使用hGH 罹患 Creutzfeldt-Jakob disease，于1985年被禁止使用顏純、王慕逖小兒內(nèi)分泌學(xué).2006,92.192個(gè)氨基酸rhGH（ somatrem） 上世紀(jì)70年代出現(xiàn)的重組DNA 技術(shù)的發(fā)展給生長激素的量化供應(yīng)提供了發(fā)展的契機(jī)1981年，Genentech 公司利用E. Coli 包涵體技術(shù)研制出含192氨基酸的基因重組人生長激素Met-rhGH。與天然hGH相比，在N-末端多了一個(gè)蛋氨酸殘基，又稱為somatrem (Protropin) 缺點(diǎn)提取和復(fù)性工藝復(fù)雜與天然hGH 不完全一致，抗體產(chǎn)生率高，達(dá)1295.5%

13、 1、2、3Kaplan SL, et al. The Lancet.1986:697-700Takano K, et al. Acta Paediatr Scand Suppl, 1986,325:19-24.Guy Massa, et al. Clinical Endocrinology (1993) 38, 137-142191個(gè)氨基酸rhGH粉劑(somatropin)蛋白分泌技術(shù)的出現(xiàn)使人們成功表達(dá)了與天然hGH 完全一致的rhGH1987年，含191個(gè)氨基酸的rhGH(Humatrope) 經(jīng)美國FDA 批準(zhǔn)上市優(yōu)點(diǎn)：與天然hGH氨基酸順序一致，抗原性明顯降低缺點(diǎn)：采用冷凍干燥技術(shù)

14、生產(chǎn)，不可避免會(huì)增加高分子蛋白和相關(guān)蛋白，并使部分生長激素分子失活國際上主要Somatropin 粉劑品牌商品名上市時(shí)間制藥公司E. Coli 表達(dá)Humatrope03/08/1987Eli LillyNutropin11/13/1993GenentechGenotropin08/24/1995Pfizer賽增1998年8月*金賽Norditropin06/20/2000 Novo Nordisk小鼠C127Saizen10/08/1996Serono*SFDA批準(zhǔn)時(shí)間，其余均為FDA批準(zhǔn)時(shí)間1995年開始問世目前國際上共有3種水針劑產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)：避免了冷凍、干燥、再溶解過程，保持了蛋白質(zhì)的天然

15、空間構(gòu)象直接使用，勿需再溶解，而且避免污染生長激素水針劑（Somatropin水劑）產(chǎn)品名上市時(shí)間制藥公司Nutropin AQ12/29/1995GenentechNorditropin Nordiflex06/20/2000Novo Nordisk賽增水劑2005*金賽* SFDA 批準(zhǔn)時(shí)間，余均為美國FDA 批準(zhǔn)上時(shí)間長效緩釋粉劑（Nutropin Depot）1999年，PLGA 微球包裹技術(shù)(類似于長效達(dá)菲林的微球包裹技術(shù)）的長效生長激素Nutropin Depot，在美國上市用于治療兒童和成人GHDNutropin Depot 是由疏水性的PLGA 微球包裹的rhGH 緩釋劑型，實(shí)

16、現(xiàn)1個(gè)月或2周注射1次；人類第一個(gè)也是最后一個(gè)把PLGA微球技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的產(chǎn)品Nutropin Depot 制備過程中需將rhGH 制成極高濃度的凍干粉，并需短暫高溫，導(dǎo)致其中rhGH高分子蛋白及相關(guān)蛋白產(chǎn)生，從而使Nutropin Depot 活性較低，抗原性較強(qiáng)比活 2.57 IU/mg抗體產(chǎn)生率：57%由于療效不佳，抗體高及價(jià)格高等問題，于2004年退市 Silverman BL, et al. J Pediatr Endocrinol Metab 2002,15 Suppl 2:715-722. 長效生長激素水劑：金賽增（2010年上市）國際領(lǐng)先（諾和公司PEG-GH尚在一期臨床）通過化學(xué)偶聯(lián)方法使聚乙二醇分子與蛋白質(zhì)分子偶聯(lián)，通過分子量的加大使半衰期延長PEG 化學(xué)修飾能夠保護(hù)被修飾蛋白的生物學(xué)活性，降低免疫原性1不易聚合產(chǎn)生高分子蛋白保護(hù)rhGH 分子免于被脫氨、氧化產(chǎn)生相關(guān)蛋白PEG-rhGH活性更高：約7IU/mg2PEG-rhGH 抗體產(chǎn)生率更低：0%* 來自金賽藥業(yè)PEG-rhGH II期和 III 期臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)1 Webster R, et al. Drug Metab Dispos 2007,35:9-162 李湛軍. 中國臨床藥理學(xué)和治療學(xué) 20