癌癥相關(guān)microRNA的熒光生物傳感及活細(xì)胞成像方法研究

1、癌癥相關(guān) microRNA 的熒光生物傳感及活細(xì)胞成像方法研究MicroRNAs（miRNAs足一類存在于真核細(xì)胞內(nèi)的非編碼 RN的子，由1824個(gè)核甘酸組成。miRNAsffi過降解目標(biāo)mRNAE抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯調(diào)控基因表達(dá)。miRNAW以調(diào)控多種生物過程,例如早期發(fā)育、免疫反應(yīng)、造血、細(xì)胞增殖、 分化和凋亡等。此外，越來越多的研究表明，miRNAs的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生和 發(fā)展密切相關(guān), 已被用作重要的癌癥診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。因此,miRNAs的特異和靈敏檢測對(duì)于癌癥的診斷和治療具有重要意義。 miRNAM有一些特有性質(zhì)，例如尺寸短、表達(dá)水平低、同源之間序列相似、易被 酶降解等。針對(duì)這些

2、特性，研究者構(gòu)建了一些基于核酸擴(kuò)增策略的 miRNA僉測方法。雖 然這些方法在一定程度上提高了 miRNA檢測的靈敏度和特異性，然而miRNA勺檢 測仍然存在一些不足和挑戰(zhàn):1）現(xiàn)有的miRNAiM別模式只能在有限的功能區(qū)域內(nèi) 發(fā)揮識(shí)別作用 , 不能完全區(qū)別堿基錯(cuò)配位置分布在各種區(qū)域的同源性miRNA;2）蛋白酶介導(dǎo)的信號(hào)擴(kuò)增策略用于細(xì)胞內(nèi)miRNA勺檢測時(shí)，蛋白酶的入胞需要將細(xì)胞固定化，容易造成細(xì)胞受損或死亡，無法滿足活細(xì)胞中miRNA僉測的需要；3）目 前miRNA勺檢測多為單重檢測，miRNA的多重檢測對(duì)于癌癥的準(zhǔn)確診斷和治療更 具有指導(dǎo)意義;4）如何以miRNA乍為邏輯輸入構(gòu)建邏輯平臺(tái)

3、實(shí)現(xiàn)癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和 不同表型癌細(xì)胞的鑒別?本論文針對(duì)已有的不足和挑戰(zhàn), 設(shè)計(jì)了四種實(shí)驗(yàn)方案用于miRNA勺生物傳感檢測和活細(xì)胞成像研究。本文分為以下六章：第一章為緒論部分，主要概述了 miRNA的特征、作用機(jī) 理、 生物學(xué)意義和已有的檢測方法, 并總結(jié)了已有檢測方法存在的不足。 第二章 ,構(gòu)建了一種分裂式識(shí)別模式結(jié)合級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增策略用于 miRNA勺高特異和靈敏檢測。設(shè)計(jì)兩種識(shí)別探針，包括具有粘性末端的發(fā)夾探針(HP)和輔助探針(AP)。首 先,HP的粘性末端和AP同時(shí)識(shí)別miRNA勺一部分，HP通過粘性末端介導(dǎo)的鏈置換 反應(yīng)打開，形成穩(wěn)定的DNAY結(jié)構(gòu)。接下來,DNA Y型結(jié)構(gòu)中的AP可以進(jìn)

4、一步作為引物觸發(fā)鏈置換擴(kuò)增(SDA)反 應(yīng) , 產(chǎn)生大量的 trigger 序列。 最后 ,trigger 序列與設(shè)計(jì)為具有G 四倍體互補(bǔ)序列和Nt.BbvCI內(nèi)切酶切刻位點(diǎn)的鎖式DNAfe交，啟動(dòng)循環(huán)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)反應(yīng)， 產(chǎn)生大量 G 四倍體序列。G四倍體序列能夠結(jié)合N-甲基-嚇咻IX(NMM),生成用于miRNA僉測的增強(qiáng)的 熒光信號(hào)。本策略中，miRNA的識(shí)別序列被分裂在兩種不同的識(shí)別探針中。無論堿基錯(cuò)配位點(diǎn)位于何種位置, 粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)的速率變化和直接雜交反應(yīng)熱力學(xué)能量變化的協(xié)同作用，使得DNA Y型結(jié)構(gòu)無法穩(wěn)定形成。該 識(shí)別模式的雙重識(shí)別效應(yīng)保證了本策略良好的特異性。由

5、于級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增反應(yīng)高的擴(kuò)增效率, 本策略能夠靈敏檢測 let-7b, 檢測限為3.2 pM。而且，本策略還對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7b的含量進(jìn)行了測定。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本工作為臨床診斷和疾病治療中 miRNA勺檢測提供了一 種有潛力的策略。第三章，基于DNAzyme區(qū)動(dòng)的三維DNAwalker和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (HCR)級(jí)聯(lián)信號(hào)擴(kuò)增，構(gòu)建了一種無酶免標(biāo)記的熒光生物傳感器用于 miRNA勺檢 測。首先 walking probe 與 locking DNA 雜交 , 使 walking probe 中的 DNAzyme 功能區(qū)域被封住，形成被鎖住的walking probe(BWPs)。然

6、后，將BWPS5發(fā)夾DNA底物(HDSs)修飾在磁球的表面。當(dāng)miRN的在時(shí),miRNA與locking DNA雜交，使得locking DNA 通過粘性末 端介導(dǎo)的鏈置換的方式從 BWPst釋放下來，暴露出DNAzyme勺功能區(qū)域。然 后,walking probe 沿著三維的軌道運(yùn)動(dòng)，切割HDSs產(chǎn)生大量的觸發(fā)鏈。最后，觸發(fā)鏈啟動(dòng)隨后的HCRS程，產(chǎn)生大量完整的G四倍體序列。G四倍體 序列能夠結(jié)合NMM產(chǎn)生用于miRNA僉測的增強(qiáng)的熒光信號(hào)。與蛋白酶驅(qū)動(dòng)的三維 DNA walker相比,DNAzymej區(qū)動(dòng)的DNA walker更加簡 單和穩(wěn)定。所有的DNAS件都修飾在同一個(gè)磁球上，大大增

7、加了探針的局部濃度 和反應(yīng)效率。而且 , 磁球可以通過外加磁場分離出去, 保證了較低的背景信號(hào)。三維DNAwalker和HC骸聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)的高擴(kuò)增效率確保了木策略良好的靈敏度，檢測 限為 7.9 fM 。而且，本策略還對(duì)HeLa細(xì)胞裂解液中l(wèi)et-7a的含量進(jìn)行了測定。以上結(jié)果 表明本工作為miRNA勺定量檢測提供了一種有潛力的策略。第四章,構(gòu)建了一種pH響應(yīng)型ZnOl內(nèi)米探針介導(dǎo)的DNAzym縝號(hào)擴(kuò)增策略用 于多重miRNAsB勺靈敏檢測和活細(xì)胞成像。設(shè)計(jì)核殼狀的納米探針，包括作為載體 和輔因子提供者的ZnOM米粒子（ZnO NPs法和用于吸附功能性發(fā)夾 DNASl勺聚多 巴胺殼。在堿性條

8、件下，多巴胺通過自聚過程沉積在 ZnO NPs的表面上。功能性發(fā)夾 DNAsffi過冗-冗相互作用吸附在聚多巴胺殼上。當(dāng)ZnO納米探針通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酸性環(huán)境會(huì)使ZnO NPs核降解，釋放出功能性發(fā)夾DNAsffi Zn2+。釋放出的Zn2+可以作為輔因子催化DNAzym助割擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，避免了額外的輔因子細(xì)胞遞送過程識(shí)別發(fā)夾DNA&括目標(biāo)物的識(shí)別序列和被鎖住的 DNAzym區(qū)域。報(bào)告發(fā)夾DNAfeS5 DNAzym的底物部分和標(biāo)記在末端的熒光團(tuán)和猝滅劑。識(shí)別發(fā)夾DNAK別miRN斫暴露出DNAzymcg域。暴露出的DNAzymcg域在Zn2+的存在下切割報(bào)告發(fā)夾DNAW

9、底物部分，熒光團(tuán)和猝滅劑相互遠(yuǎn)離，使熒光 恢復(fù)。釋放出的識(shí)別發(fā)夾DNAf口 miRNA勺雜交雙鏈繼續(xù)循環(huán)切割報(bào)告發(fā)夾 DNA產(chǎn) 生增強(qiáng)的熒光信號(hào)用于靈敏檢測 miR-21和miR-373,檢測限分別為54 pM和38 pM 本策略對(duì)三種細(xì)胞內(nèi) miR-21 的不同表達(dá)水平進(jìn)行了區(qū)分, 而且在同一種活細(xì)胞內(nèi)對(duì) miR-21 和 miR-373 進(jìn)行了同時(shí)成像。以上結(jié)果表明，本策略在癌癥準(zhǔn)確診斷和治療領(lǐng)域的 miRN夠重分析中具有 潛在應(yīng)用。第五章，構(gòu)建了基于MNAzymeU割擴(kuò)增反應(yīng)的DNAS輯平臺(tái)用于癌癥 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和癌細(xì)胞鑒別。MNAzyme指分裂式的DNAzyme在DNAzyme勺催化中心處分裂后添加目標(biāo)物的傳感臂, 形成兩條獨(dú)立的催化鏈Part A 和 Part B 。當(dāng)miRNA存在時(shí)，Part A和Part B獨(dú)立存在，不能形成完整的催化中心， 無法切割底物鏈，保證了較低的背景信號(hào)。當(dāng) miRNAff在時(shí),Part A和Part B的 目標(biāo)物傳感臂能夠同時(shí)識(shí)別 miRNA形成完整的MNAzyme（合物。該復(fù)合物綁定底物鏈，在Mrn2+l勺輔助下循環(huán)切割底物鏈，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào)用于癌癥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和癌細(xì)胞鑒別。將本策略用于癌細(xì)胞鑒別時(shí), 由于細(xì)胞內(nèi)的金屬離子不足以催化 MNAzym切割擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，MnO%內(nèi)米片被作為探針入 胞的載體。MnO2內(nèi)米片能夠在細(xì)