臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)：衰老免疫與免疫學(xué)檢驗(yàn)

1、衰老免疫與免疫學(xué)檢驗(yàn)第二十六章衰老（aging，senescence）指生物體隨著年齡增長(zhǎng)在組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能等方面出現(xiàn)的一系列慢性、進(jìn)行性和退化性變化，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)內(nèi)、外環(huán)境適應(yīng)能力逐漸減退以至喪失。機(jī)制復(fù)雜，涉及到基因程序性表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目改變、組織結(jié)構(gòu)和器官調(diào)節(jié)功能變化；免疫系統(tǒng)的衰老出現(xiàn)最早，對(duì)人體影響最大，與疾病關(guān)系最密切，機(jī)體衰老的主要原因。免疫衰老（immunosenescence）免疫功能隨著增齡而逐步發(fā)生減退與紊亂的現(xiàn)象，是由基因控制的免疫系統(tǒng)循序漸進(jìn)的自然退化過(guò)程。表現(xiàn)為免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答能力減弱，以及免疫功能的紊亂。第一節(jié)衰老時(shí)免疫系統(tǒng)的表現(xiàn)一、免疫器官中樞免

2、疫器官：骨髓和胸腺；外周免疫器官：脾臟、淋巴結(jié)等結(jié)構(gòu)萎縮與功能退化1、胸腺： T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，“衰老中心”。重量變化：新生兒1416g青春期35 45g 逐年縮??；基質(zhì)細(xì)胞合成的胸腺素減少，表達(dá)的MHC分子密度降低；結(jié)果：前T細(xì)胞的分化、成熟過(guò)程受阻，免疫功能下降；2、骨髓紅髓/黃髓比例隨年齡增大而下降，造血干細(xì)胞減少，脂肪細(xì)胞增多；免疫細(xì)胞生成速率下降，3、外周免疫器官脾臟、淋巴結(jié)萎縮，二、免疫細(xì)胞數(shù)量與功能的變化（一）T淋巴細(xì)胞1、數(shù)量減少，功能降低，各亞群比例變化；數(shù)量減少(mm3)：5x103 2x1031.6x103 嬰兒 青春期老年并伴隨不成熟T細(xì)胞增多； 2、T細(xì)胞表面CD

3、分子的變化：CD4和CD8: 與MHC分子的非多肽區(qū)結(jié)合，增強(qiáng)T細(xì)胞抗原識(shí)別受體（TCR）與抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞的親和力，并有利于激活信號(hào)的傳遞。衰老T細(xì)胞表面CD4/8分子密度較少CD28: 位于T細(xì)胞表面，與抗原提呈細(xì)胞上的CD80/CD86 (B7-1/2) 結(jié)合，為T(mén)細(xì)胞活化提供必須的協(xié)同刺激信號(hào)。來(lái)自CD28的T細(xì)胞活化第二信號(hào)的缺乏將導(dǎo)致免疫應(yīng)答無(wú)能。T細(xì)胞老化的標(biāo)志性變化是CD28-的T細(xì)胞增多，尤其CD8+T中CD28表達(dá)下降更為明顯。CD28表達(dá)下降將導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)有絲分裂原反應(yīng)下降，同時(shí)對(duì)凋亡刺激敏感。CD45: 白細(xì)胞共同抗原，具蛋白酪氨酸磷酸酶活性，可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)

4、傳導(dǎo)，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的活化。存在多種異構(gòu)體，如CD45RO、CD45RA、CD45RB。在T細(xì)胞成熟和活化過(guò)程的不同階段表達(dá)不同類型的異構(gòu)體。 CD45RO記憶性T細(xì)胞，CD45RA 未受刺激的初始T細(xì)胞， CD45RB 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)老年人CD45RO+T比例增多, CD45RA+T比例減少,對(duì)未接觸過(guò)的新抗原刺激的免疫應(yīng)答能力下降。初始性T細(xì)胞減少，記憶性T細(xì)胞增加3、T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能的變化Peptide- MHCTCR/CD4/8 CD80/86 CD28蛋白酪氨酸激酶（PTK）磷脂酶C- ( PLC- )磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）三磷酸肌醇（IP3）甘油二酯（DAG）絲裂原

5、激活的蛋白激酶（MAPK）DNA復(fù)制、靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+通道Ca2+ 鈣調(diào)素(calmodulin) 鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)轉(zhuǎn)錄因子 NF-AT 去磷酸根蛋白激酶C (PKC)NF-kB磷酸化入核 4、細(xì)胞因子的變化輔助性T細(xì)胞（Th）活化后產(chǎn)生的細(xì)胞因子中，Th1型細(xì)胞因子隨年齡增加而減少，Th2型細(xì)胞因子隨年齡增加而增多；IL-2下降最明顯，同時(shí)血清中sIL-2R水平升高；IL-4增多，可導(dǎo)致多克隆B細(xì)胞激活，易導(dǎo)致自身免疫性疾?。煌庵苎醒装Y性細(xì)胞因子IL-6增多，易引起自身抗體和淋巴瘤發(fā)病率增加； 5、T細(xì)胞端粒長(zhǎng)度變化端粒：染色體末端特殊結(jié)構(gòu)，由

6、220kb串聯(lián)的短片段重復(fù)序列（TTAGGG）n和一些結(jié)合蛋白組成，具有維持細(xì)胞分裂和保護(hù)染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、完整性的作用。端粒會(huì)隨著DNA復(fù)制逐漸縮短，當(dāng)端粒長(zhǎng)度丟失到一定長(zhǎng)度時(shí)，引起染色體變性，染色體間融合，細(xì)胞不再增生，從而進(jìn)入老化或增生狀態(tài)；（二）B淋巴細(xì)胞1、細(xì)胞數(shù)量：總數(shù)明顯變化不大，但是CD5+B細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增多，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞依賴抗原（蛋白質(zhì)抗原）刺激的應(yīng)答能力明顯下降，對(duì)非依賴型抗原（如脂多糖）的應(yīng)答能力增強(qiáng)，分泌低特異性的IgM。2、血清免疫球蛋白：水平相對(duì)穩(wěn)定或增高，但是類別發(fā)生改變，高親和力抗體水平下降；感染性疾病發(fā)生率增高；3、自身抗體：水平增高（三）其他類型

7、免疫細(xì)胞功能變化1、NK細(xì)胞：殺傷活性無(wú)抗原特異性、不依賴抗體、無(wú)MHC限制性，主要針對(duì)腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞，總數(shù)下降；2、抗原提呈細(xì)胞：專職（樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞）、非專職（血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等）表現(xiàn)出數(shù)量或者功能上的變化；3、紅細(xì)胞：依靠細(xì)胞膜表面的補(bǔ)體受體CR1（C3bR、C4b、C2b）黏附補(bǔ)體-抗體-抗原復(fù)合物，促進(jìn)吞噬細(xì)胞清除循環(huán)血流中的免疫復(fù)合物，防止其沉積引起的超敏反應(yīng)性疾病，同時(shí)可促進(jìn)補(bǔ)體成分的失活，從而防止補(bǔ)體過(guò)度活化引起的組織細(xì)胞損傷；CR1表達(dá)下降，細(xì)胞出現(xiàn)結(jié)團(tuán)成串、變性、脫水現(xiàn)象；易發(fā)生免疫復(fù)合物沉積引起的超敏反應(yīng)性疾?。患t細(xì)胞通過(guò)末端毛細(xì)血管

8、能力下降，代謝產(chǎn)物無(wú)法有效清除，引起代謝復(fù)合物沉積，進(jìn)而引起組織器官的衰老和病變。第二節(jié)、與老年人免疫異常相關(guān)的疾病一、老年人免疫異常的主要特點(diǎn)1、免疫缺陷和免疫異常增強(qiáng)同時(shí)存在，導(dǎo)致免疫功能紊亂；2、免疫防御和免疫監(jiān)視功能下降，不能正常識(shí)別和清除病原體的侵襲；對(duì)腫瘤細(xì)胞的弱抗原喪失了識(shí)別能力，導(dǎo)致不能及時(shí)清除體內(nèi)變異細(xì)胞；3、免疫自穩(wěn)功能異常，對(duì)自身抗原免疫應(yīng)答增強(qiáng)，產(chǎn)生多種自身抗體或自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。二、老年人易患的免疫性疾病（一）、衰老性感染免疫活性細(xì)胞數(shù)量和功能降低，防御和殺傷病原微生物的效能減弱，易引發(fā)感染性疾病，同時(shí)由于其神經(jīng)反應(yīng)不敏感，導(dǎo)致患病后缺乏典型癥狀和特征，如無(wú)明顯發(fā)

9、熱。同時(shí)對(duì)疫苗免疫接種無(wú)效。（二）、老年性自身免疫病免疫功能失調(diào)引起外源抗原刺激后的特異性免疫應(yīng)答能力減弱，對(duì)自身抗原的反應(yīng)加強(qiáng)，導(dǎo)致自身抗體或自身反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生。抗核抗體、抗線粒體抗體、抗甲狀腺抗體及類風(fēng)濕因子增多；抗核抗體增多導(dǎo)致體細(xì)胞分裂能力降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、橋本甲狀腺炎、惡性貧血、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化癥、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、重癥肌無(wú)力等。（三）、惡性腫瘤高發(fā)于5570歲的人；細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能減弱，NK細(xì)胞數(shù)量減少；易發(fā)生多發(fā)性癌癥；隱匿癌增多：無(wú)癥狀的潛伏腫瘤，發(fā)展緩慢，一般也非致 死病因；癥狀不典型：（四）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease,

10、AD）多見(jiàn)于老年人，以記憶力減退、認(rèn)知障礙、人格改變?yōu)樘卣鞯臐u進(jìn)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，但公認(rèn)與衰老相關(guān)；腦組織內(nèi)-淀粉樣蛋白（amyloid protein, A）的產(chǎn)生與清除失衡有關(guān)， A大量聚集并沉積，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用；AD的免疫機(jī)制：小膠質(zhì)細(xì)胞第三節(jié)衰老的免疫學(xué)檢驗(yàn)T細(xì)胞衰老是導(dǎo)致機(jī)體衰老和免疫衰老相關(guān)疾病的重要因素。一、T細(xì)胞的檢測(cè)（一）T細(xì)胞數(shù)量及其CD表型1、T細(xì)胞總數(shù)；2、初始T細(xì)胞與記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)及其比值：CD45RA/CD45RO;3、CD28分子在初始T細(xì)胞上的表達(dá)程度；流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)相關(guān)標(biāo)記分子的熒光強(qiáng)度，評(píng)價(jià)T細(xì)胞的衰老程度；（

11、二）、細(xì)胞因子1、IL-2及IL-2R2、IL-1/、IL-6 、TNF- 3、ELISA（三）、細(xì)胞增生功能T淋巴細(xì)胞的增殖功能降低，對(duì)PHA刺激反應(yīng)敏感性降低二、B細(xì)胞的檢測(cè)（一）、B細(xì)胞及其亞群1、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD5、CD19、CD20;2、細(xì)胞總數(shù)變化不大，CD5+B細(xì)胞比例增高，代表B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答下降；（二）、免疫球蛋白與自身抗體1、相對(duì)穩(wěn)定，但是特異性抗體生成量減少，2、自身抗體水平，異常Ig 如RF升高三、衰老與端粒長(zhǎng)度的檢測(cè)端粒是染色體末端重復(fù)的核苷酸序列，能維持染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中保持完整的功能。其本身在細(xì)胞分裂的過(guò)程中會(huì)逐漸變短，相關(guān)研究結(jié)果表明端粒長(zhǎng)度與人的

12、健康狀況、壽命、疾病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。DNA印跡法（Southern blot）、熒光原位雜交、流式細(xì)胞熒光原位雜交、定量PCR（一）、DNA印跡法Sample material: Cell cultures and other biological samplesProtocolStep 1: Digestion of genomic DNAPurified genomic DNA is digested by an optimized mixture of frequently cutting restriction enzymes. The enzymes have been selected

13、in such a way that telomeric DNA and sub-telomeric DNA is not cut. This is due to the special sequence characteristics of the repeats. Non-telomeric DNA is digested to low molecular-weight fragments.Step 2: Gel electrophoresis and Southern blottingFollowing DNA digestion, the DNA fragments are separ

14、ated by gel electrophoresis, then transferred to a nylon membrane by Southern blotting.Step 3: Hybridization and chemiluminescence detectionThe blotted DNA fragments are hybridized to a digoxigenin (DIG)-labeled probe that is specific for telomeric repeats, then incubated with a DIG-specific antibod

15、y covalently coupled to alkaline phosphatase. Finally, the immobilized telomere probe is visualized by a highly sensitive chemiluminescent substrate for alkaline phosphatase, CDP-Star. The average TRF length can be determined by comparing the signals to a molecular-weight standard. Hinf I/Rsa I（二）、熒光原位雜交、1、細(xì)胞培養(yǎng)制備處于有絲分裂中期的染色體涂片變性DNA 雜交（CCCTAAFITC/Cy3)n DAPI或PI負(fù)染熒光顯微鏡檢測(cè)熒光信號(hào)(端粒定量)2、用肽核酸（PNA, peptide