中科大基礎(chǔ)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)五 植物葉片過(guò)氧化物同工酶的PAGE分析

1、實(shí)驗(yàn)5 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacryamide gel electrophoresis PAGE)分離植物過(guò)氧化物酶同工酶 1. 目的要求(1)了解聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。(2)掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術(shù)。(3)了解同工酶研究在理論和實(shí)踐中的重要意義。PAGE實(shí)驗(yàn)中用到的試劑：簡(jiǎn)稱化學(xué)名稱作用Acr丙烯酰胺單體Bis甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑AP過(guò)硫酸銨催化劑TEMED四甲基乙二胺加速劑Tris三羥甲基氨基甲烷緩沖配對(duì)離子SDS十二烷基硫酸鈉變性劑2. 原理2.1 生物大分子性質(zhì) 生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子

2、的相互作用。在電場(chǎng)中，帶電顆粒向陰極或陽(yáng)極遷移，遷移方向取決與它們帶電的符號(hào)。 紙電泳、瓊脂糖電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳2.2 聚丙烯酰胺凝膠聚合原理及有關(guān)特性2.2.1 聚合反應(yīng) 聚丙烯酰胺是由單體(Acr)、交聯(lián)劑(Bis)，在催化劑(AP或核黃素) 和加速劑(TEMED)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。丙烯酰胺（Acr）：是凝膠的最主要成分，單體聚合形成長(zhǎng)鏈。甲叉雙丙烯酰胺(Bis)：是交聯(lián)劑，將聚丙烯酰胺鏈交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。過(guò)硫酸銨(AP)或核黃素(Vb2)：提供自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。四甲基乙二胺（TEMED）：是加速劑，它催化過(guò)硫酸銨形成自由基。 對(duì)核黃素引發(fā)的光聚

3、合也有加速作用。化學(xué)聚合：使用AP作催化劑，常用于制備分離膠（小孔膠）。過(guò)量氧會(huì)影響鏈的延長(zhǎng)和聚合，所以過(guò)硫酸銨(AP)催化的化學(xué)聚合要水封以隔O2。光聚合：使用核黃素作催化劑，聚合反應(yīng)需光照， 適用于制備濃縮膠(大孔膠)。應(yīng)控制AP和TEMED的用量，使凝膠在40min-1hr之間聚合完全為宜。2.2.2 凝膠孔徑的可調(diào)性及其有關(guān)性質(zhì)(1)凝膠性能與總濃度及交聯(lián)度的關(guān)系： T%（Acr和Bis總濃度）= (a+b)/m 100 C% (交聯(lián)劑百分比) = b/(a+b) 100 其中，a= Acr克數(shù)，b= Bis克數(shù)，m=緩沖液體積（ml） 欲制備完全透明而又有彈性的凝膠， 應(yīng)控制a/b=

4、30左右。 經(jīng)驗(yàn)公式: C = 6.5 0.3 T（2）凝膠濃度與孔徑的關(guān)系：T濃度大，孔徑小，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力大。T濃度小，孔徑大，移動(dòng)顆粒穿過(guò)網(wǎng)孔阻力小。（3）凝膠濃度與被分離物分子量的關(guān)系： 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過(guò)可移動(dòng)顆粒的分子量也不同.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳原理PAGE電泳根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)2大類， 本次實(shí)驗(yàn)利用不連續(xù)系統(tǒng).PAGE不連續(xù)電泳膠由濃縮膠和分離膠組成，具有較高的分辨率，是因?yàn)樵陔娪倔w系中集“樣品濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)及電荷效應(yīng)”為一體。 實(shí)驗(yàn)原理圖1 樣品濃縮效應(yīng)(1)凝膠孔徑不連續(xù)性(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)

5、性(3)電位梯度的不連續(xù)性(1)凝膠孔徑不連續(xù)性:濃縮膠 T=3% 孔徑大分離膠T=7%或7.5% 孔徑小在2層凝膠交界處，由于凝膠孔徑的不連續(xù)性使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。 (2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性:Tris:緩沖配對(duì)離子，維持溶液的電中性及pH值Cl-:在電場(chǎng)中遷移率快，前導(dǎo)離子(leading ion) ，快離子。Gly:其pI =6.0，在pH6.7的濃縮膠緩沖體系中，甘氨酸解離度很小，因而在電場(chǎng)中遷移很慢，稱為尾隨離子（trailing ion），慢離子。 當(dāng)進(jìn)入pH8.9的分離膠時(shí)，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過(guò)蛋白質(zhì);因此Cl-及NH2CH2COO-沿著

6、離子界面繼續(xù)前進(jìn)。蛋白質(zhì)分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多個(gè)區(qū)帶. 大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時(shí)均帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中，都向正極移動(dòng)。(3)電位梯度的不連續(xù)性V(電泳速度)=E(電位梯度)8 * m(遷移率)E高m慢E低m快由于蛋白質(zhì)的有效遷移率恰好介于快、慢離子之間，因此也就聚集在這個(gè)移動(dòng)的界面附近，被濃縮形成一個(gè)狹小的中間層。2 分子篩效應(yīng)分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小且為球形的蛋白質(zhì)分子所受阻力小，移動(dòng)快，走在前面;反之，則阻力大，移動(dòng)慢，走在后面。分子篩效應(yīng)不同于柱層析中的分子篩效應(yīng)，

7、后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。3 電荷效應(yīng)進(jìn)入pH8.9的分離膠中，各種蛋白質(zhì)所帶凈電荷不同，而有不同的遷移率。表面電荷多，則遷移快；反之，則慢各種蛋白質(zhì)按電荷多少、分子量及形狀，以一定順序排成一個(gè)個(gè)條型的區(qū)帶，從而達(dá)到分離的目的。2.4 植物過(guò)氧化物酶同工酶的測(cè)定原理 (1)植物同工酶凡能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶稱同工酶。植物組織中的同工酶（isoenzyme）是基因表達(dá)的產(chǎn)物。 每一種植物都有相同的遺傳信息，其表達(dá)產(chǎn)物與植物的發(fā)育和所處的環(huán)境有十分密切的關(guān)系，植物不同組織和器官有不同的形態(tài)特征和化學(xué)組成，從而合成不同的酶蛋白。在研究植物基

8、因調(diào)控與生長(zhǎng)發(fā)育、與環(huán)境條件的關(guān)系以及許多生理生化和遺傳問(wèn)題時(shí)，常常需要分析同工酶譜的差異。(2) 過(guò)氧化物酶同工酶的測(cè)定 過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)常見(jiàn)的氧化酶。植物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程常與它的活性及其同工酶的種類有關(guān)。利用過(guò)氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理，將經(jīng)過(guò)電泳后的凝膠置于有H2O2及聯(lián)苯胺的溶液染色，出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的部位即為過(guò)氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過(guò)氧化物酶同工酶譜。3. 試劑和樣品1 測(cè)試樣品 新鮮植物葉片。2 試劑 (1) 分離膠緩沖液: 3M Tris（HCl） pH8.8 (2) 分離膠貯液（30% Acr-0.8% B

9、is）：4貯存，一般可放置1個(gè)月左右。 (3)濃縮膠緩沖液: 0.5M Tris(HCl) pH6.7 (4)濃縮膠貯液（10% Acr-2.5% Bis）: 4貯存，一般可放置1個(gè)月左右。 (5) Tris-Gly電極緩沖液 pH8.3 注意：Acr和Bis是對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時(shí)應(yīng)避免直接接觸和吸入它的粉末。 (6) 40% 蔗糖溶液(W/V)。(7)TEMED(濃度98%)(8) 0.14% 過(guò)硫酸胺（AP）： 4貯存僅能用一周，最好當(dāng)天配制。(9) 0.1%溴酚藍(lán)指示劑聯(lián)苯胺染色母液：聯(lián)苯胺1g + 冰醋酸18ml + H2O 2ml溶解儲(chǔ)于棕色瓶中。 注意：（1）聯(lián)苯胺的毒

10、性很強(qiáng)，其固體和蒸氣都能通過(guò)皮膚迅速進(jìn)入體內(nèi)，引起惡心、嘔吐，損害肝和腎臟。聯(lián)苯胺及它的鹽都是致癌物質(zhì)。 （2）聯(lián)苯胺染色液要當(dāng)天配制。4. 操作方法4.1 制膠架裝配4.2 分離膠制備 7.5，配12ml，混合后的凝膠溶液，用槍加至兩層玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約0.5cm，上覆蓋 12mm高的蒸餾水或水飽和的異丁醇，用于隔絕空氣，使膠面平整，靜置30分鐘-1小時(shí)使其聚合。4.3 濃縮膠制備 4%，配4ml ，混合均勻后用槍將凝膠溶液加到長(zhǎng)、短玻璃板的窄縫內(nèi)(即分離膠上方)，插入加樣梳，梳齒下不要有氣泡存在，光下靜置30分鐘-1小時(shí)使其凝合。7.5%分離膠和2.5%濃縮膠的

11、配方試劑用量（ml)7.5%分離膠2.5%濃縮膠分離膠緩沖液(PH8.8)1.530%分離膠貯液3.0濃縮膠緩沖液(PH6.7)0.510%濃縮膠貯液 1.0ddH2O1.50.50.14% 過(guò)硫酸胺（AP）6.02.0TEMED0.0040.002 4.4 將完成聚合的膠板由制膠架上取下，安裝到電極組件上，帶凹槽的內(nèi)板面向U形硅膠框，兩側(cè)用夾子夾緊。一個(gè)電極組件可同時(shí)帶兩個(gè)膠板。 在膠板與電極組件之間的內(nèi)槽中加入1X 的稀釋電極液（pH8.3）至超過(guò)內(nèi)板0.5cm，但不要漫過(guò)電極組件. 在底盤中加入電極液至沒(méi)過(guò)膠板底緣0.5cm. 每組需配1X 的稀釋電極液（pH8.3）250ml4.5 制

12、備樣品（過(guò)氧化物酶的提?。┓Q取1g待測(cè)植物新鮮樣本置于冰浴上的研缽內(nèi)，加入1ml 0.05 mol/l Tris-HCl緩沖液（PH 6.7） 研成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管，再用2 ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，12000 rpm 離心5 min，其上清液即為酶的提取液，供電泳分析用。4.6 加樣 石楠葉S1 40 l + 40%蔗糖40 l ，混勻，分3孔：10、20、30l桂花葉S2 40 l + 40%蔗糖40 l ，混勻，分3孔：10、20、30 l 垂柳葉S3 40 l + 40%蔗糖40 l ，混勻，分3孔：10、20、30 l加樣時(shí).用槍分別取10、20、30l樣品蔗糖混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到三個(gè)凝膠凹形樣品槽內(nèi)在第一個(gè)樣品槽加l溴酚藍(lán) 作為指示劑上樣與電泳4.7 電泳： 正確連通電泳儀與電泳槽(電極紅紅，黑 黑，切勿接錯(cuò))，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，將電壓調(diào)至90V，穩(wěn)壓。待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)，將電壓調(diào)至150V。當(dāng)藍(lán)色染料遷移至距離膠板下緣0.5cm時(shí)，將電壓調(diào)回到零，關(guān)電。倒掉電極液，取下膠板，用牛角勺柄輕輕將一塊玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。 注