環(huán)境微生物學(xué)-實(shí)驗(yàn)四(五) 細(xì)菌的純培養(yǎng)、分離

1、- -實(shí)驗(yàn)四（五）環(huán)境中微生物分離與培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾堆肥等）中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，獲得若干種細(xì)菌純種培養(yǎng)技能。2、掌握幾種接種技術(shù)。3、了解菌種的保藏方法。二、實(shí)驗(yàn)儀器和材料恒溫箱、涂布器、細(xì)鐵絲、接種環(huán)、酒精燈、吸耳球、棉花、記號(hào)筆；無菌培養(yǎng)皿（直徑90毫米）、無菌移液管（1毫升和10毫升）；肉湯蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基；活性污泥或土壤10克、無菌水90毫升、9毫升無菌水（試管中）；酵母、大腸桿菌。三、細(xì)菌純種分離的操作方法細(xì)菌純種分離的方法有兩種：稀釋平板法和平板劃線法。（一）稀釋平板分離的方法1、取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場(chǎng)取一定數(shù)量

2、的活性污泥或土壤，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。2、稀釋水樣將1瓶90毫升和5管9毫升的無菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次編號(hào)。在無菌操作條件下，將樣品（10克）置于第一瓶90毫升無菌水中，用手搖10分鐘，將顆粒狀樣品打散，即為10-1濃度的菌液。用1毫升無菌移液管吸取1毫升10-1濃度的菌液于一管9毫微升無菌水中，同樣方法，依次稀釋到10-6。每次稀釋時(shí)，需用不同的無菌移液管，或?qū)⑼灰埔汗苡脽o菌水洗三次。3、平板的制作取10套無菌培養(yǎng)皿編號(hào)，10-4、10-5、10-6各3個(gè)，另1個(gè)為空氣對(duì)照。取1支1毫升無菌移液管從濃度小的10-6菌液開始，以10-6、10

3、-5、10-4為序分別吸取0.5毫升菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻），加熱熔化培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基冷至45C左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)，然后觀察結(jié)果。取對(duì)照無菌培養(yǎng)皿，打開皿蓋10分鐘后蓋上皿蓋，倒置30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察結(jié)果。（二）平板劃線分離法1、平板的制作將融化并冷至50C的瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成

4、平板。2、操作用接種環(huán)挑取一環(huán)活性污泥（或土壤懸液等），左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線（切勿劃破培養(yǎng)基），劃線的方式可取交叉法和平行法。劃線完畢后，蓋好皿蓋，倒置30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察結(jié)果。四、幾種接種技術(shù)操作由于實(shí)驗(yàn)的目的、所研究的微生物種類、所用的培養(yǎng)基及容器的不同，接種方法也有多種，現(xiàn)簡介如下：1、接種用具常用的接種用具有接種環(huán)、接種針、接種鉤、接種鏟、移液管、滴管等。接種環(huán)和接種針總長約25厘米，環(huán)、針、鉤的長為4.5厘米，可用白金或鎳絲制成。上述材料以白金

5、絲最為理想，其優(yōu)點(diǎn)是：在火焰灼燒后冷卻快，不易氧化且無毒。但價(jià)格昂貴，一般用鎳絲。接種環(huán)的柄為金屬的，其后端套上絕熱材料套，柄也可用玻璃棒制作。2、接種環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)、接種等操作需在經(jīng)紫外線滅菌的無菌操作室、無菌操作箱、生物超凈工作臺(tái)等條件下進(jìn)行。教學(xué)實(shí)驗(yàn)由于人多，無菌室小，無法一次容納所有實(shí)驗(yàn)者，所以，在一般實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，這時(shí)要特別注意無菌操作，也可分組分批進(jìn)行。3、幾種接種技術(shù)1）斜面接種技術(shù)這是將長在斜面培養(yǎng)基（或平板培養(yǎng)基）上的微生物接到另一支斜面培養(yǎng)基上的方法。接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌子上；將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人、組別、姓名等；點(diǎn)燃酒精

6、燈。將一支斜面菌種和一支待接的斜面培養(yǎng)基放在左手上，拇指壓住兩支試管，中指位于兩支試管之間，斜面向上，管口齊平，右手先將棉塞擰松動(dòng)，以便接種時(shí)拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將接種環(huán)燒紅（環(huán)以上凡是可能進(jìn)入試管的部分都應(yīng)灼燒）。在火焰旁，用右手小指、和無名指和手掌夾住棉塞將它拔出。試管口在火焰微燒一周，將管口上可能沾染的少量菌或帶菌塵埃被燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先觸及沒長菌的培養(yǎng)基使環(huán)冷卻，然后輕輕挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出管外迅速伸入另一試管底部，在斜面上由底部向上劃曲線。抽出接種環(huán)，將試管塞上棉塞并插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。2）液體培養(yǎng)基中的菌種被接入液體培養(yǎng)基接

7、種用具是無菌移液管和無菌滴管，移液管和滴管是玻璃制成的，不能在火焰上燒，以免碰到水時(shí)玻璃破裂，需預(yù)先滅菌。用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。3）液體接種這是由斜面培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基中的方法。用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌種送入液體培養(yǎng)基中，使環(huán)在液體表面與管壁處輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入液體培養(yǎng)基中，取出接種環(huán)，塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在液體培養(yǎng)基中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅。4）穿刺接種這是將斜面菌接種到固體或半固體深層培養(yǎng)基的方法。如斜面接種操作，用接種針（必須很挺直）挑取少量菌種，將帶菌種的接種針刺入半固體深層培養(yǎng)基中直

8、到接近管底，然后沿穿刺線緩慢地抽出，塞上棉塞，燒紅接種針，則接種完畢。5）稀釋平板涂布法稀釋平板涂布法與稀釋平板法、平板劃線法的作用一樣，都是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個(gè)菌落的分離方法。此法接種量不宜太多，只能在1毫升以下，培養(yǎng)時(shí)起初不能倒置，先正擺一段時(shí)間等到水分蒸發(fā)后倒置。此法步驟如下：稀釋樣品方法與稀釋平板法中的稀釋方法和步驟一樣。倒平板將融化的并冷至50C左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當(dāng)稀釋的樣品液于平板上，換上無菌涂布器在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻。正擺在所需溫度的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)時(shí)間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。待長出菌落

9、觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟1、用平板涂布法從土壤中分離菌種取樣稀釋水樣平板的制作培養(yǎng)觀察記數(shù)2、平板劃線分離法制作平板平板劃線3、斜面接種接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌子上；將試管貼上標(biāo)簽，注明菌名、接種日期、接種人組別、姓名等；點(diǎn)燃酒精燈；接種；培養(yǎng)；后觀察。六、菌種的保藏（一）基本原理微生物具有容易變異的特性。因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)，使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，微生物的保藏方法也是依據(jù)它們而設(shè)計(jì)的。（二）保藏方法保藏方法大致可分為以下幾種：1、傳代培養(yǎng)

10、保藏法傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用）。將菌種接種到適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包好，培養(yǎng)后于46C冰箱內(nèi)保存。保藏時(shí)間依微生物的種類而不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細(xì)菌可保存24個(gè)月，再移種一次。酵母菌兩個(gè)月，細(xì)菌最好每月移種一次。此法為實(shí)驗(yàn)室和工廠菌種室常用的保藏法，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，使用方便，不需特殊設(shè)備，能隨時(shí)檢查所保藏的菌種是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點(diǎn)是容易變異，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的物理、化學(xué)性質(zhì)不是嚴(yán)格恒定的。多次傳代會(huì)使微生物是代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機(jī)會(huì)也較多。2、液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變

11、相方法，能夠適當(dāng)延長保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，從而減弱代謝作用。此法實(shí)用而且效果好。霉菌、放線菌、芽孢細(xì)菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般無芽孢的細(xì)菌也可保藏1年。此法的優(yōu)點(diǎn)是制作簡單，不需特殊設(shè)備，且不需經(jīng)常移種。缺點(diǎn)是保存時(shí)必須直立放置，所占位置較大，同時(shí)也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時(shí)，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應(yīng)特別注意。3、載體保藏法是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體。如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙

12、保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。濾紙保藏法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設(shè)備。沙土保藏法多用于產(chǎn)生孢子的微生物，但應(yīng)用于營養(yǎng)細(xì)胞效果不佳。4、寄主保藏法此法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其它方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。5、冷凍保藏法冷凍保藏法可分為低溫冰箱（-20-30C,-50-80C）、干冰快速凍結(jié)（約-70C）和液氮（-196C）等保藏法。液氮法保存效果良好,但需要特殊設(shè)備。6、冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70C左右）下快速冷凍、然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。此法為微生物保藏方法中最有效的方法之一。適用于菌種長期保存,一般保存數(shù)年至數(shù)十年,但設(shè)備和操作多很復(fù)雜。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液,以防止因冷凍或水份不斷升華對(duì)細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子