15級(jí)碩士研究生《蛋白質(zhì)組學(xué)》試題及參考答案

1、說明本頁勿需打?。悍饷妫罕驹囶}頁打印出來作為試卷封面A4紙。請(qǐng)用藍(lán)色簽字筆或鋼筆書寫，字跡公正，行距恰當(dāng)。每道題的答案前寫上番號(hào)即可。請(qǐng)按學(xué)位類別完成試卷。請(qǐng)負(fù)責(zé)同學(xué)按學(xué)號(hào)整理試卷后按時(shí)交卷。聯(lián)系 ：交卷時(shí)間：2023-12-21重慶醫(yī)科大學(xué)2023級(jí)學(xué)術(shù)型碩士研究生?蛋白質(zhì)組學(xué)?試題 學(xué)位：醫(yī)學(xué) 姓名 學(xué)號(hào) 所在院系 123456789平時(shí)成績(jī)總分列舉蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的樣品制備技術(shù)。簡(jiǎn)述雙向電泳技術(shù)的原理及其特點(diǎn)10分。答：1激光捕獲顯微切割技術(shù)LCM、高豐度蛋白去除技術(shù)、自由流電泳技術(shù)FFE2原理：根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個(gè)方向上按照等電點(diǎn)上下進(jìn)行別

2、離，在第二個(gè)方向上按照相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行別離。二維電泳別離后的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)顯色，通過圖象掃描存檔，最后是呈現(xiàn)出來的是二維方向排列的，呈漫天星狀的小原點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)。特點(diǎn)：雙向電泳分辨率最高：信息量最大；pH梯度穩(wěn)定；重復(fù)性好。如何保證亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的樣品純度10分？答：細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的比重和大小都不相同，在同一離心場(chǎng)內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級(jí)別離出來。別離細(xì)胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進(jìn)行別離，其過程包括組織細(xì)胞勻漿、分級(jí)別離和分析三步。勻漿，低溫條件下，將組織放在勻漿器中，參加等滲勻漿介

3、質(zhì)即0.25molL蔗糖-0.003molL氯化鈣進(jìn)行破碎細(xì)胞，使之成為各種細(xì)胞器及其包含物的勻漿。分級(jí)別離，由低速到高速離心逐漸沉降。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)均勻分布在整個(gè)離心管中，所以每級(jí)離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復(fù)懸浮和離心加以純化。分析分級(jí)別離得到的組分，可用細(xì)胞化學(xué)和生化方法進(jìn)行形態(tài)和功能鑒定。一般從三個(gè)方面對(duì)亞細(xì)胞器的純度進(jìn)行評(píng)價(jià)：1電子顯微鏡檢測(cè)2.標(biāo)志酶活性測(cè)定3.Westernblot。舉例說明藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在新藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用10分。答：藥物蛋白質(zhì)組學(xué)主要應(yīng)用于：1臨床前研究-發(fā)現(xiàn)所有可能的藥物作用靶點(diǎn)，以及針對(duì)這些靶點(diǎn)的全部

4、可能的化合物，以及應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究藥物作用機(jī)制和毒理學(xué)；2臨床研究方面-發(fā)現(xiàn)藥物作用的特異蛋白作為患者選擇有效藥物的依據(jù)和臨床診斷的標(biāo)志物，或以蛋白質(zhì)譜的差異將患者分類并給予個(gè)體化治療。舉例：藥物蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)中的應(yīng)用研究人員通過比較給藥前后的蛋白質(zhì)組，找到了藥物阿霉素抗乳腺癌的一個(gè)作用靶標(biāo)Hsp27。2瘧原蟲入侵血紅細(xì)胞的阻斷靶點(diǎn)探測(cè)：半胱氨酸蛋白水解酶是瘧原蟲生存必需的酶，Greenbaum等利用靶向半胱氨酸蛋白水解酶的化學(xué)探針I(yè)125-DCG-04打靶，然后通過抗DCG-04的生物素純化，得到了半胱氨酸蛋白水解酶類的亞蛋白質(zhì)組；通過酶活性分析，最終發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲的入侵

5、血紅細(xì)胞的裂殖期，僅有一個(gè)有半胱氨酸蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)falcipain1；從數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到falcipain1的抑制劑YA29-Eps，結(jié)果證實(shí)YA29-Eps可阻斷瘧原蟲的入侵紅細(xì)胞。4、試述免疫共沉淀的原理及其優(yōu)缺點(diǎn)，并舉例說明主要用途10分。答：免疫共沉淀原理：是以抗體-抗原之間的專一性作用為根底的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。根本原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保存下來。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能被沉淀下來。該技術(shù)可用于鑒定兩種目標(biāo)蛋白

6、質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合以及進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析，還可用來篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用伙伴。優(yōu)點(diǎn)：相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以防止人為的影響。缺點(diǎn)：1.需要高質(zhì)量的抗體進(jìn)行IP；2.兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；3.檢測(cè)不到弱或瞬時(shí)的相互作用。技術(shù)用途：1.鑒定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合，以及進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)分析；2.篩選一種特定蛋白質(zhì)的新的作用伙伴。請(qǐng)比較蛋白印跡技術(shù)和免疫組化的異同10。答：免疫組化又稱免疫細(xì)胞化學(xué)，利用抗原抗體特異性反響對(duì)組織細(xì)胞中的特寫抗原或抗體進(jìn)行定位和定性的一種染色技術(shù)。為了顯示和觀

7、察細(xì)胞內(nèi)抗原抗體反響，需要預(yù)先將某種示蹤性物質(zhì)結(jié)合到特定的抗體上，借標(biāo)記示蹤物的熒光或酶的有色反響、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定量或定位觀察。根據(jù)顯示物質(zhì)的不同，分為免疫熒光技術(shù)、免疫酶技術(shù)、親和組織化學(xué)技術(shù)和免疫金銀技術(shù)等，以免疫酶技術(shù)最為常用。免疫印跡又稱為Western blot，是先借助凝膠電泳將蛋白質(zhì)抗原別離，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至膜上，使之成為被別離蛋白的一個(gè)拷貝?？乖奈恢镁涂捎锰禺愋钥贵w確定。免疫印跡可以用來檢測(cè)樣品中是否存在蛋白抗原，以及該抗原的含量或該抗原多肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量等。它還可用于確定蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基是否發(fā)生了磷酸化。免疫印跡高效、簡(jiǎn)便、靈敏

8、。免疫組化呈現(xiàn)的是天然狀態(tài)的抗原，而免疫印跡使抗原完全變性，并且局部純化，但需要與固相支持物結(jié)合。這也使二者需要不同特性的抗體。免疫組化用于抗原的定位與半定量，但如果需要對(duì)抗原表達(dá)進(jìn)行精確定量，還是需要做免疫印跡，更具說服力。質(zhì)譜儀的組成要件和以MALDI TOF MS獲得PMF的分析流程10分。答：1質(zhì)譜儀一般由進(jìn)樣裝置、離子化原、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。2MALDI-TOF-MS分析肽混合物時(shí)，能耐受適量的緩沖劑、鹽，而且各個(gè)肽片幾乎都只產(chǎn)生單電荷離子，因此MALDI-TOF成為進(jìn)行分析PMF的首選方法。1.將待測(cè)樣品與基質(zhì)混合并置于樣品板上枯燥。2.將樣品板放入質(zhì)譜儀的

9、樣品。3.樣品點(diǎn)被激光脈沖照射，解吸，離子化。4.離子被電場(chǎng)加速，進(jìn)入真空漂移管5.離子的m/z不同，飛行時(shí)間不同，先后到達(dá)檢測(cè)器。6將別離得到的結(jié)果，與數(shù)據(jù)庫(kù)比照，得到肽質(zhì)量指紋譜后，再在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢鑒定蛋白質(zhì)。談?wù)勓獫{蛋白質(zhì)組學(xué)研究中需要著重注意的問題以及目前多維策略的研究進(jìn)展10分。答：1、血漿/血清樣品選擇去血小板的血漿由于防止血小板的激活作用，減少了蛋白質(zhì)的體外降解，因而較血清更適合一定的肽組學(xué)研究；去血小板的EDTA血漿或枸櫞酸血漿樣品，更適合分析低分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)；如果要使用一定的蛋白酶抑制劑，一定要在早期參加，而且要謹(jǐn)慎使用，因?yàn)橐种苿┑膮⒓涌赡軐?duì)MS分析造成一定的干擾，而且一

10、些小分子的抑制劑與蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)的亞型，這些都將使得分析結(jié)果變得復(fù)雜。2、樣品的收集與貯存為減少血小板的污染，血液樣品在分析前最好用0.2m的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜過濾，樣品分裝冰凍儲(chǔ)存，減少融化-再冰凍的循環(huán)；樣品應(yīng)分裝并貯存在液氮中，減少或不加蛋白酶抑制劑，以減少對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。3、去除高豐度蛋白和分級(jí)技術(shù)血漿/血清樣品中蛋白質(zhì)種類很多，而且所含蛋白質(zhì)具有較大的動(dòng)力學(xué)范圍，其中有許多豐度較高但不含有特殊生物學(xué)信息的蛋白質(zhì)，這將會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析造成極大的困難，甚至根本不能檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)，因此，通過對(duì)原始蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫和分步別離減少樣品中蛋白質(zhì)的復(fù)雜性，可以極大簡(jiǎn)化蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)和分析，

11、提高對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別的靈敏度和準(zhǔn)確度。4、多維策略的運(yùn)用：聯(lián)合使用不同技術(shù)平臺(tái)并加以適當(dāng)改進(jìn)是目前最通用的手段：主要包括：去除高豐度蛋白、樣本預(yù)別離系統(tǒng)、別離系統(tǒng)、質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)試述臨床腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究的標(biāo)本及其特點(diǎn)10分。答：1組織細(xì)胞標(biāo)本如手術(shù)切除和穿刺活檢組織：組織細(xì)胞新鮮，組織形態(tài)保存好，可協(xié)助臨床對(duì)病變作出診斷或?yàn)榧膊≡\斷提供線索。了解病變性質(zhì)、開展趨勢(shì)，判斷疾病的預(yù)后。驗(yàn)證及觀察藥物療效，為臨床用藥提供參考依據(jù)。發(fā)現(xiàn)新的疾病或新的類型，為臨床科研提供病理組織學(xué)依據(jù)。2) 福爾馬林固定-石蠟包埋組織：組織形態(tài)保存好，穿透性強(qiáng)，組織收縮少，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀

12、察；石蠟塊還能長(zhǎng)期存檔，供回憶研究。3各種體液：1乳頭溢液、痰液、淚液等 2尿液3各種消化液胰液、胃液、唾液等4腦脊液、關(guān)節(jié)腔液5血液*液體活檢6腫瘤間質(zhì)液：對(duì)外周血中游離DNA和循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其中的核酸和蛋白質(zhì)等進(jìn)行全面分析，以防止侵入性的活檢；取樣患者腫瘤的全部片段，可以評(píng)估腫瘤的異質(zhì)性。反映出腫瘤的大致輪廓，包括當(dāng)時(shí)患者腫瘤的所有突變 、甚至癌細(xì)胞擴(kuò)散的方式和路徑。結(jié)合自己專業(yè)，簡(jiǎn)述應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法尋找疾病標(biāo)志物的程序步驟及相應(yīng)技術(shù)10分。 答：步驟：1、鼻咽癌細(xì)胞系/組織的全蛋白質(zhì)表達(dá)譜構(gòu)建：腫瘤蛋白質(zhì)組表達(dá)譜及其蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是深入開展腫瘤蛋白質(zhì)組相關(guān)研究的根底。LCM純化，2DE

13、、MS別離鑒定差異表達(dá)蛋白，Western Blot驗(yàn)證，免疫組化驗(yàn)證。鼻咽癌與正常鼻咽上皮的比較蛋白質(zhì)組學(xué)篩選標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞與其起源的正常細(xì)胞的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究是發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物和治療靶標(biāo)的最直接和合理的方式之一。為提高腫瘤標(biāo)志物篩選的準(zhǔn)確性，有必要從組織中純化靶細(xì)胞用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究樣本收集；別離和鑒定；表達(dá)驗(yàn)證；功能驗(yàn)證。技術(shù)： 經(jīng)典的2-DE在一定范圍內(nèi)得到應(yīng)用，能直接比較蛋白質(zhì)水平的差異。直接質(zhì)譜法之色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：蛋白酶解為多肽，再鑒定和定量這些多肽，即可獲得原始蛋白的質(zhì)和量的信息；包括標(biāo)記法和非標(biāo)記法；該操作相對(duì)簡(jiǎn)單；但由于原始蛋白的一些信息會(huì)在酶解時(shí)喪失

14、(如蛋白降解)，其結(jié)果是不全面的 直接MALDI基質(zhì)輔助激光解吸電離SELDI外表增強(qiáng)激光解吸電離,即不酶解，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析；更適用于高通量研究，但是后續(xù)的蛋白質(zhì)多肽鑒定往往成為這類實(shí)驗(yàn)的瓶頸 其它方法：包括基于抗體的方法,如自身抗體、抗體芯片等。如：血清蛋白組學(xué)分析：即分別用病人和正常人的血清作為一抗，篩選腫瘤組織中的差異蛋白質(zhì)，即腫瘤抗原。其實(shí)質(zhì)是 2DE + 免疫印跡技術(shù)流程：腫瘤組織或細(xì)胞總蛋白2DE別離轉(zhuǎn)膜膜與病人血清及對(duì)照血清反響質(zhì)譜鑒定差異反響點(diǎn)的蛋白確定腫瘤抗原。病人血清及對(duì)照血清：差異的就是前者有針對(duì)腫瘤抗原的抗體 1通過蛋白組學(xué)技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TM舉例2組學(xué)技術(shù)可提高診斷的敏感性和特異性3腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)的必要性。如童急性淋巴細(xì)胞性白血病蛋白標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。先應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)，比較兒童ALL患者血清和健康兒童血清的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，尋找患者與健康兒童血清中的差異蛋白，確定潛在的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，然后利用HPLC別離純化差異蛋白，最后利用MALDI-TOF-MS 及LC-MSMS鑒定