流感病毒基礎(chǔ)知識(shí)

1、流感的危害流行性感冒簡(jiǎn)稱流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有傳染性強(qiáng)、流行面廣、潛伏期短、發(fā)病率高等特點(diǎn)，在兒童、老人及高危人群中的死亡率很高。有數(shù)據(jù)表明，每年冬季流感爆發(fā)期會(huì)使全球人口近10感染致病。流感病毒簡(jiǎn)介流行性感冒病毒（influenza virus）簡(jiǎn)稱流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原體，屬于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。(是與粘液蛋白有特殊親和性病毒中的1科)粘病毒是指對(duì)人或某些動(dòng)物紅細(xì)胞表面的黏蛋白有親和力的病毒。正、副粘病毒的區(qū)分以其核酸是否分節(jié)段為標(biāo)準(zhǔn)，分節(jié)段者為正粘病毒，不分節(jié)段者為副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一個(gè)種。（一）形態(tài)與結(jié)

2、構(gòu)流感病毒具有多形態(tài)，一般為球形，也有的呈絲狀或桿狀，病毒直徑為80-120nm。流感病毒的結(jié)構(gòu)主要包括內(nèi)部的核心、衣殼（核衣殼）和外面的包膜（附圖）。Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference 22) 1、核心（core） 流感病毒的核酸為分節(jié)段、負(fù)鏈單股RNA，稱為分節(jié)段基因組（segmented genome）。其中甲型和乙型流感病毒的核酸分為8個(gè)節(jié)段，而丙型流感病毒的分為7個(gè)節(jié)段。每一基因節(jié)段分別編碼不同的蛋白，決定流感病毒的遺傳特性。第16基因節(jié)段分別編碼RNA多聚酶（RNA polyme

3、rase）PB2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因節(jié)段編碼包膜蛋白，包括內(nèi)膜基質(zhì)蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8節(jié)段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。流感病毒各基因節(jié)段復(fù)制后，組裝入子代病毒體中，但在組裝過程中極易發(fā)生基因重組而導(dǎo)致新病毒株的出現(xiàn)，這是流感病毒容易發(fā)生變異而出現(xiàn)大流行的主要原因。2、衣殼（caspid） 核蛋白是流感病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒衣殼卷曲包繞在RNA外，并與3種RNA多聚酶（PB1、P

4、B2、PA）一起與RNA節(jié)段形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），即螺旋對(duì)稱的核衣殼。RNA多聚酶PB1、PB2、PA與RNA的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，核蛋白的抗原性穩(wěn)定，很少發(fā)生變異，具有型特異性。3、包膜（envelop） 流感病毒包膜由內(nèi)向外，可分為內(nèi)膜基質(zhì)蛋白（matrix protein, MP）和脂蛋白（lipoprotein，LP）兩層。內(nèi)膜基質(zhì)蛋白M1，是包圍在病毒核心外的一層膜結(jié)構(gòu)，介于核蛋白與脂質(zhì)雙層膜之間，與組成脂質(zhì)雙層膜的類脂緊密結(jié)合，在維持病毒形狀與完整性上起重要作用，具有型特異性。脂蛋白層是脂質(zhì)雙層膜的結(jié)構(gòu)成分，來源于宿主細(xì)胞膜或核膜?；|(zhì)蛋白M2為鑲嵌其

5、中的膜蛋白，形成膜通道，有利于病毒脫殼及血凝素的生成。流感病毒包膜上鑲嵌的兩種糖蛋白向外突出形成刺突（spike），一種是血凝素（hemagglutinin，HA），另一種是神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, NA）。HA的數(shù)量是NA的45倍。(1) 血凝素（HA） 流感病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合部位，是病毒侵入宿主細(xì)胞所必需的，因能與多種動(dòng)物（如雞、豚鼠）及人類紅細(xì)胞表面的糖蛋白受體相結(jié)合并引起紅細(xì)胞的凝聚而得名。HA是流感病毒的主要中和抗原，其表面有五個(gè)抗原決定簇，抗HA抗體能夠抑制血凝及中和病毒，抑制病毒從感染細(xì)胞中釋放出來，是重要的保護(hù)性抗體。這一重要特征使抗HA的抗體能夠?qū)α鞲胁《井a(chǎn)

6、生免疫作用。但HA的抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其抗原性的變異，這也成為流感病毒亞型分類的主要依據(jù)。(2) 神經(jīng)氨酸酶（NA） 具有酶活性，可水解宿主細(xì)胞糖蛋白末端的N-乙酰神經(jīng)氨酸，有利于成熟病毒的釋放，并可防止新生病毒體的聚集。NA也具有抗原性，抗NA抗體可以抑制新生流感病毒從宿主細(xì)胞內(nèi)釋放，但沒有中和病毒的作用。NA的抗原結(jié)構(gòu)較易發(fā)生變異，是流感病毒亞型劃分的另一依據(jù)。（二）分型、變異與流行根據(jù)核蛋白與內(nèi)膜基質(zhì)蛋白M1抗原性的不同，可把感染人類的流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型流感病毒對(duì)人類及多種動(dòng)物有致病力，是Smith于1933年從雪貂的鼻腔分泌液中首次分離出

7、來的。乙型流感病毒僅對(duì)人類有致病力，是1940年由Francis和Magill發(fā)現(xiàn)的。丙型流感病毒于1947年由Taylor發(fā)現(xiàn)，是對(duì)人類危害較小的非臨床病原體。各型流感病毒又根據(jù)其表面HA及NA抗原性的不同再分為若干亞型，目前已發(fā)現(xiàn)16個(gè)HA亞型（H1H16）和9個(gè)NA亞型（N1N9），而病毒的命名也是據(jù)此表示的，人類間流行的亞型主要是H1、H2、H3和N1、N2。流感病毒的抗原性結(jié)構(gòu)由于分節(jié)段基因組的存在，使病毒在復(fù)制中易發(fā)生重組變異，從而產(chǎn)生新的亞型。通過對(duì)世界上過去流感流行的資料分析發(fā)現(xiàn)，甲型流感病毒的表面抗原HA、NA最易變異，二者可同時(shí)變異，也可分別變異。乙型和丙型流感病毒的抗原性

8、比較穩(wěn)定。自1933年分離出甲型流感病毒以來，已發(fā)生多次世界性的大流行（附表）以及大流行間期的小流行。其流行規(guī)模的大小，主要取決于病毒表面抗原變異幅度的大小。附表 甲型流感病毒抗原變異情況流行年代病毒亞型代表病毒株* 抗原結(jié)構(gòu)1934-1946A（原甲型）A/PR/8/34H0N11946-1957A1（亞甲型）A/FM/1/47H1N11957-1968A2（亞洲甲型）A/Singapore/1/57H2N21968-1997A3（香港甲型）A/Hong Kong/1/68H3N21977-A1A3（香港甲型與亞甲型）A/USSR/90/77H1N1*代表病毒株：型別/病毒分離地點(diǎn)/毒株序號(hào)

9、/分離年代（19），例如，A/Hong Kong/1/68表示甲型/香港/1/1968年。流感病毒的變異與流感的流行性密切相關(guān)，可分為抗原性漂移（antigenic drift）和抗原性轉(zhuǎn)變（antigenic shift）。變異幅度小，屬于量變的稱抗原性漂移，是由核酸序列的點(diǎn)突變致使HA和NA抗原表位發(fā)生某些改變或人群免疫力選擇性的不同而造成的，可以使流感病毒不受宿主免疫系統(tǒng)的作用。這類變異屬于亞型內(nèi)變異，可引起中小流行。若變異幅度大，即新毒株的HA和/或NA完全與前次流行株失去聯(lián)系，形成新的亞型，屬于質(zhì)變的則稱抗原性轉(zhuǎn)變，是由核酸序列不斷的突變積累或外來基因片段重組所致。這種抗原性的轉(zhuǎn)變使

10、人群原有的特異性免疫力失效，因此可以引起大規(guī)模甚至世界性的流感流行。關(guān)于流感病毒抗原性轉(zhuǎn)變的機(jī)制有兩種學(xué)說，一種是基因突變（gene mutation），流感病毒經(jīng)過人群免疫力的自然篩選，抗原性的變異經(jīng)歷一個(gè)從量變到質(zhì)變的過程，直至形成新的亞型，這一過程需要1015年；另一種是基因重新配對(duì)（gene reassortment），新的流感病毒亞型來源于人類流感病毒不同亞型之間或人類與動(dòng)物流感病毒之間的基因重新配對(duì)，如1957年的H2N2亞型的HA、NA、PB1的基因來自于禽流感病毒，其他5個(gè)基因片段來自于人類的H1N1亞型；1968年的H3N2亞型是由人類的H2N2亞型與一株鴨流感病毒基因重新配

11、對(duì)產(chǎn)生的。1999年，香港首次從人體中分離得到H9N2亞型禽流感病毒。禽流感（avian influenza, AI）是由甲型流感病毒引起的一種急性傳染病，主要發(fā)生在禽類，也發(fā)生在哺乳動(dòng)物甚至人類。迄今，已有多起世界高致病性禽流感暴發(fā)的報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，高致病性禽流感的致病性極強(qiáng)，可導(dǎo)致家禽近100%死亡，1g受污染的禽類糞便所含的病毒可以感染100萬只家禽，對(duì)禽類危害較大的有H5、H7、H9亞型毒株。一般情況下，禽流感病毒不感染鳥類以外的動(dòng)物。2003年12月至2004年3月，禽流感（H5N1）在日本、韓國、越南、泰國、中國等國家出現(xiàn)，其中越南、泰國出現(xiàn)人類感染禽流感病毒的病例并造成死亡。流感

12、病毒感染過程流感病毒經(jīng)飛沫傳播，進(jìn)入呼吸道，然后侵入呼吸道黏膜細(xì)胞并進(jìn)行增殖。病毒的復(fù)制過程分為吸附、穿入、脫殼、生物合成及裝配與釋放五個(gè)步驟。（一）吸附（absorption）帶有流感病毒顆粒的飛沫（直徑一般小于10m）侵入呼吸道后，病毒的NA破壞神經(jīng)氨酸，使粘蛋白水解，糖蛋白受體暴露，從而實(shí)現(xiàn)糖蛋白受體與HA（含糖蛋白成分）的結(jié)合。這是一種專一性吸附，具特異性，能被抗HA抗體所抵制。（二）穿入（penetration）流感病毒在與易感細(xì)胞結(jié)合后，在其附著處的細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成一個(gè)將包膜病毒包囊在內(nèi)的小體，然后病毒包膜與宿主細(xì)胞融合。（三）脫殼（uncoating）在宿主細(xì)胞溶酶體酶的作用下，

13、衣殼脫去，釋放出病毒RNA。（四）生物合成（biosynthesis）流感病毒RNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，在RNA多聚酶的參與下，以親代病毒-ssRNA為模板，復(fù)制出互補(bǔ)的+ssRNA，形成復(fù)制中間型。然后復(fù)制中間型解鏈，互補(bǔ)的+ssRNA發(fā)揮mRNA的功能，翻譯出病毒結(jié)構(gòu)蛋白和酶；同時(shí)以互補(bǔ)的+ssRNA為模板，復(fù)制出大量的子代-ssRNA（附圖）。附圖 負(fù)股單鏈RNA（-ssRNA）病毒（如流感病毒）的生物合成（五）裝配與釋放（assembly and release）合成的子代病毒RNA和衣殼蛋白在胞質(zhì)中參加裝配，形成子代病毒核衣殼。然后以出芽的方式，不斷通過細(xì)胞膜，釋放到胞外，同時(shí)獲得包膜

14、，從而成為有感染性的真正意義上的子代病毒。新生的子代病毒即由感染的呼吸道黏膜向周圍組織擴(kuò)散?！玖鞲胁《驹诩?xì)胞膜上獲得包膜，然后以出芽的方式釋放出成熟病毒。病毒的出芽釋放不直接引起宿主細(xì)胞死亡，因?yàn)榧?xì)胞膜在出芽之后可以被修復(fù)，宿主細(xì)胞仍能進(jìn)行正常的新陳代謝。病毒以出芽方式釋放后，也將病毒成分留在細(xì)胞膜上，使感染細(xì)胞具有免疫原性，引起免疫應(yīng)答。包膜上的脂質(zhì)來自宿主細(xì)胞，可因在不同細(xì)胞內(nèi)增殖而不同，但包膜的蛋白質(zhì)由病毒的核酸編碼，故具有病毒的特異性及免疫原性?！俊靖阶ⅲ嚎乖侵敢环N能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生 HYPERLINK /view/66869.htm t _blank 抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與

15、這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？乖幕灸芰κ?HYPERLINK /view/291903.htm t _blank 免疫原性immunogenicity和 HYPERLINK /view/1122297.htm t _blank 反應(yīng)原性 reactiongenicity。免疫原性又稱為 HYPERLINK /view/116546.htm t _blank 抗原性，是指能夠刺激機(jī)體形成特異抗體或致敏淋巴細(xì)胞的能力。反應(yīng)原性是指能與由它刺激所產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)。具備免疫原性和反應(yīng)原性兩種能力的物質(zhì)稱為完全抗原，如 HYPERLINK /view/91398.

16、htm t _blank 病原體、異種動(dòng)物 HYPERLINK /view/42775.htm t _blank 血清等。只具有反應(yīng)原性而沒有免疫原性的物質(zhì)，稱為 HYPERLINK /view/291905.htm t _blank 半抗原，如 HYPERLINK /view/1680.htm t _blank 青霉素、 HYPERLINK /view/29486.htm t _blank 磺胺等。半抗原沒有免疫原性，不會(huì)引起免疫反應(yīng)。但在某些特殊情況下，如果半抗原和大分子蛋白質(zhì)結(jié)合以后，就獲得了免疫原性而變成完全抗原，也就可以刺激 HYPERLINK /view/36052.htm t _

17、blank 免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體和效應(yīng)細(xì)胞。在青霉素進(jìn)入體內(nèi)后，如果其降解產(chǎn)物和組織蛋白結(jié)合，就獲得了免疫原性，并刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗青霉素抗體。當(dāng)青霉素再次注射人體內(nèi)時(shí)，抗青霉素抗體立即與青霉素結(jié)合，產(chǎn)生病理性免疫反應(yīng)，出現(xiàn) HYPERLINK /view/771316.htm t _blank 皮疹或 HYPERLINK /view/279009.htm t _blank 過敏性休克，甚至危及生命。】病毒在黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，造成這些細(xì)胞變性、壞死、脫落，黏膜充血、水腫，腺體分泌增加。經(jīng)過12天的潛伏期，感染者即可出現(xiàn)流感癥狀，如打噴嚏、鼻塞、咳嗽等。病毒在上皮細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，很少入血，但可釋放內(nèi)毒

18、素樣物質(zhì)入血，引起全身中毒癥狀，如發(fā)熱、頭痛、全身酸痛、疲乏無力、白細(xì)胞數(shù)下降等。流感病毒感染發(fā)病率雖高，但一般數(shù)日內(nèi)自愈。幼兒或年老體弱者易繼發(fā)細(xì)菌感染，如合并肺炎等，病死率高。抗流感藥物的靶點(diǎn)基于對(duì)流感病毒復(fù)制周期（replicative cycle）的理解，可以發(fā)現(xiàn)，抑制或阻斷其中的任一環(huán)節(jié)均能實(shí)現(xiàn)對(duì)流感的控制。結(jié)合流感病毒的結(jié)構(gòu)和功能，可以用來設(shè)計(jì)抗流感藥物的靶點(diǎn)有：神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, NA）、血凝素（hemagglutinin，HA）、RNA多聚酶、M2離子通道。其中又以NA最受關(guān)注，后面將單獨(dú)加以詳述。在此先對(duì)后三者做一簡(jiǎn)述。（一）血凝素（hemaggluti

19、nin，HA）HA是由3條相同的糖基化多肽以非共價(jià)形式聚合而成的三聚體（trimer），在病毒感染的初始階段起著兩個(gè)非常重要的作用：受體結(jié)合與膜融合。前者能夠使病毒吸附于宿主細(xì)胞表面的神經(jīng)氨酸受體，后者導(dǎo)致病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合而使病毒RNA及相關(guān)酶進(jìn)入細(xì)胞。當(dāng)HA單體被宿主細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶切割裂解成HA1（重鏈）和HA2（輕鏈）時(shí)，流感病毒才表現(xiàn)出感染性。其中，HA1是與宿主細(xì)胞膜神經(jīng)氨酸受體結(jié)合的亞單位；HA2其N末端的疏水性氨基酸序列，是融合結(jié)構(gòu)域，而其C末端附近的氨基酸序列則插入病毒包膜的脂質(zhì)雙層膜中，是HA與病毒包膜的結(jié)合部位。HA1和HA2共同作用可以使流感病毒吸附于宿主細(xì)胞

20、表面，成為流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的先決條件。HA與宿主細(xì)胞膜神經(jīng)氨酸受體結(jié)合作用較弱，但協(xié)同結(jié)合可加強(qiáng)其作用。盡管自然界有大分子量的流感病毒HA抑制劑（在人的呼吸道分泌物中有一種可溶性黏液蛋白，也具有流感病毒受體能結(jié)合HA，從而抵制病毒侵入細(xì)胞，但只有在流感癥狀出現(xiàn)后，呼吸道黏液分泌增多時(shí)，才有一定的防護(hù)作用）存在，但開發(fā)單一結(jié)合配體的努力迄今尚未獲得成功。HA的活化裂解對(duì)于其感染性是必需的，故而也是一個(gè)誘人的靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示，在組織培養(yǎng)和小鼠肺臟中，某些蛋白酶抑制劑確實(shí)能有效地抑制病毒復(fù)制。由細(xì)支氣管上皮Clara細(xì)胞分泌的一種蛋白酶被發(fā)現(xiàn)可以裂解HA0成HA1和HA2，并且這種酶的抑制劑也被考

21、慮用于臨床。不幸的是，由于Clara蛋白酶是一種宿主酶，任何用于治療流感感染的此種抑制劑均可能產(chǎn)生不良的副作用。與宿主細(xì)胞的神經(jīng)氨酸受體結(jié)合后，病毒顆粒被納入到內(nèi)涵體中。在此，pH下降且HA構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致HA2先前隱藏的N末端疏水性氨基酸序列（融合結(jié)構(gòu)域）暴露，進(jìn)而使病毒與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，病毒核酸復(fù)合物進(jìn)入胞質(zhì)開始復(fù)制。其融合機(jī)制尚不完全清楚。融合抑制劑仍在開發(fā)中，目前未見此類化合物進(jìn)入臨床的報(bào)道。（二）RNA多聚酶流感病毒是分節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA病毒，其基因轉(zhuǎn)錄、病毒蛋白翻譯及子代病毒RNA的復(fù)制均需通過正鏈RNA來完成。上述過程是在宿主細(xì)胞核內(nèi)由病毒編碼的RNA依賴的RNA多聚

22、酶實(shí)現(xiàn)的，并且此酶只存在于被感染的宿主細(xì)胞中。因此，RNA多聚酶成為又一個(gè)誘人的抗流感病毒藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，但遺憾的是，目前無相關(guān)化合物進(jìn)入臨床研究階段。（三）基質(zhì)蛋白M2基質(zhì)蛋白M2為鑲嵌于病毒包膜的膜蛋白，其功能類似于離子通道。當(dāng)病毒顆粒處在內(nèi)涵體低pH環(huán)境下及HA介導(dǎo)的融合發(fā)生前，允許H+進(jìn)入病毒顆粒中。降低病毒內(nèi)部的pH致使內(nèi)膜基質(zhì)蛋白M1從核糖核蛋白體中分離出來，從而使后者進(jìn)入宿主細(xì)胞核開始復(fù)制。目前臨床可得的抗流感藥物金剛烷胺（amantadine）和金剛乙胺（rimantadine）即屬于M2蛋白抑制劑，但該類藥物阻斷M2蛋白離子通道的作用機(jī)制僅與甲型流感病毒相關(guān)，對(duì)由乙型流感病毒引

23、起的流感無效，而且耐藥病毒株的很快出現(xiàn)和比較嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用，均使這類藥物的臨床使用受到很大影響。神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase, NA）神經(jīng)氨酸酶（NA，EC 8）即唾液酸酶（sialidase），是存在于流感病毒A和B表面的糖蛋白，在病毒的復(fù)制過程中起關(guān)鍵酶的作用。在每一個(gè)流感病毒體上存在約100個(gè)呈蘑菇狀的NA分子，該酶在許多其他病毒、細(xì)菌體和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中也廣泛存在。電鏡顯示NA包括一個(gè)方盒狀的頭部和一個(gè)細(xì)長的柄，而HA則是一個(gè)三角棒狀分子。（一）流感病毒NA的結(jié)構(gòu)甲型（H2N2）流感病毒顆粒經(jīng)鏈霉蛋白酶處理，可釋放出可溶性的小分子量NA（其四聚體的為240kD）。19

24、78年，用同樣的處理方法，從重組的含有N2亞型的流感病毒中得到了NA的“頭部”。這個(gè)200-kDa的蛋白質(zhì)含有4條完全相同的糖基化多肽，其組成部分具有膜結(jié)合NA所有的抗原性及酶學(xué)性質(zhì)59。由此獲得了NA的晶體及其X-射線衍射數(shù)據(jù)60。Fig 2. Three-dimensional structure of an N9 neuraminidase tetramer, PDB entry 7NN9. The colours change from blue (N terminus) to red (C terminus) through green along the amino acid se

25、quence.(Reference 5)1983年，Varghese等通過X-ray結(jié)晶學(xué)研究以2.9的分辨率首先確定了流感病毒NA N2亞型的三維結(jié)構(gòu)，這是結(jié)晶學(xué)上的一個(gè)創(chuàng)舉。其結(jié)構(gòu)顯示各單體均是由6個(gè)4股反平行的-折疊片狀結(jié)構(gòu)組成（Fig 2），并以類似螺旋槳葉片的形式排列、以單體的中心為軸線均勻分布。各折疊片段呈特征性排列，其中央的也是第一股平行于所謂“螺旋槳”的軸線，而最外面一股幾乎垂直于軸線。前一折疊片段的最外面一股接著與下一折疊片段的中央一股相連。病毒膜表面的這些環(huán)狀連接含有許多抗原學(xué)及酶學(xué)上的重要氨基酸11。在所有的甲型和乙型流感病毒中，NA 的活性位點(diǎn)都位于每一個(gè)糖蛋白亞單位表

26、面的口袋中。自此N961、N8、N6及乙型流感病毒62 NA的結(jié)構(gòu)先后被測(cè)定。N2、N9、N6、N8亞型結(jié)晶具有進(jìn)行衍射測(cè)定的品質(zhì)。相反，N1, N3、N5亞型雖也被結(jié)晶但并不適于結(jié)構(gòu)解析63。對(duì)N4、N7亞型結(jié)晶的嘗試并未獲得成功。（二）NA的底物及活性位點(diǎn)通過對(duì)四種來自甲型流感病毒亞型及兩種來自乙型流感病毒的酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)了一相當(dāng)保守的結(jié)構(gòu)。盡管相比于N2亞型，它們的氨基酸序列同一性低至40%，在乙型流感病毒NA中甚至低至25%。換句話說，它們具有與N2亞型NA相似的整體拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)。其四倍體對(duì)稱結(jié)構(gòu)是通過金屬離子及面向內(nèi)部的糖基側(cè)鏈來穩(wěn)定的，而糖基側(cè)鏈藏于內(nèi)部可免受免疫學(xué)影響。兩個(gè)鈣

27、離子結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)位于結(jié)合口袋附近，另一個(gè)位于四聚體軸線上。推測(cè)看來，新生病毒顆粒從宿主細(xì)胞表面釋放時(shí)，流感病毒NA的鈣離子活化作用可能在其酶活性的正性調(diào)節(jié)上發(fā)揮著重要的生理學(xué)作用。NA的活性位點(diǎn)高度保守，并存在一個(gè)催化中心。唾液酸（Sialic acid, SA, N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac, Fig 3a）本身是相對(duì)活性較弱（其Ki約為10-3M）的NA抑制劑。1969年，Meindl等報(bào)道了唾液酸的衍生物Neu5Ac2en（2-deoxy-2,3-dehydro-N- acetyl-neuraminic acid, Fig 3b），與NA的結(jié)合能力（其

28、Ki約為10-6M）比唾液酸高約1000倍，并被認(rèn)為是酶催化裂解唾液酸的過渡態(tài)類似物。Fig 3. Chemical structure of (a) N-acetyl neuraminic acid; (b) 2-deoxy-2,3- dehydro-N-acetyl neuraminic acid.催化活性位點(diǎn)是通過解析底物唾液酸與NA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)得到的。包圍唾液酸結(jié)合位點(diǎn)的口袋周圍環(huán)繞著12條環(huán)形鏈，其中6條連接第四股與下一折疊片段的第一股（L01），另6條連接第二股與第三股(L23)。在活性口袋及其周圍有大量帶電的氨基酸殘基，這些帶電殘基在迄今已知的甲型及乙型流感病毒NA序列中均高

29、度保守。它們是Arg 118, Glu 119 (on 1L01), Asp 151, Arg 152 (1L23), Asp 198 (2L23), Arg 224, Glu 227 (3L01), Asp 243 (3L23), His 274, Glu 277 (4L01), Arg 292 (1L23), Asp 330, Lys 350 (5L01), and Glu 425 (6S2)。如圖所示，酸性氨基酸Glu119, Asp 151, Asp 198, Glu 227, Asp 243, Glu 276, Glu 277, Asp 330, Glu 425; 堿性氨基酸Arg

30、118, Arg 152, Arg 224, His 274, Arg 292, Lys350; 中性氨基酸Tyr 121, Leu 134, Trp 178?？拷僖核峤Y(jié)合位點(diǎn)的其他殘基包括三個(gè)疏水性殘基，Tyr 121 (Phe in N1 and B strains), Trp 178 and Leu 134。Fig 4. Ribbon diagram of a monomer of N2 influenza NA showing the active site residues which are conserved across all influenza strains (Refe

31、rence 11 HYPERLINK / /).（三）流感病毒NA的功能結(jié)構(gòu)決定功能。簡(jiǎn)而言之，NA是甲型和乙型流感病毒侵染、復(fù)制、成熟和釋放等過程中的關(guān)鍵酶，其作用至關(guān)重要：首先，NA催化裂解并切斷末端唾液酸殘基與鄰近寡乳糖之間的(2-6)或(2-3)酮苷鍵。此鍵的斷裂對(duì)促進(jìn)流感病毒在呼吸道的內(nèi)傳播發(fā)揮著重要作用：1、實(shí)現(xiàn)病毒通過黏液的轉(zhuǎn)運(yùn)并破壞宿主細(xì)胞上的HA受體，從而促使子代病毒顆粒從被感染的宿主細(xì)胞中釋放出來。2、移去新生HA和NA糖基表面的唾液酸，對(duì)防止子代病毒從宿主細(xì)胞釋放后的自我聚集非常必要。3、通過裂解呼吸道黏膜中的唾液酸可防止病毒失活，并盡可能地促使病毒穿入呼吸道上皮細(xì)胞。其

32、次，某些毒株HA糖基的改變可能增強(qiáng)流感病毒的毒力，NA對(duì)此也有貢獻(xiàn)。它通過催化裂解以非共價(jià)形式與成熟或活性分子相結(jié)合的潛在相關(guān)肽上的唾液酸殘基，可直接激活潛在的轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor , TGF-）。這些活化的細(xì)胞因子水平的增加，會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可認(rèn)為是流感病毒NA導(dǎo)致病原性的機(jī)制之一。最近NA的纖溶酶原結(jié)合活性可決定甲型流感病毒病原性的新機(jī)制已被闡明。在小鼠身上研究發(fā)現(xiàn)，A/WSN/33 (WSN)毒株的NA結(jié)合并分離細(xì)胞表面的纖溶酶原，從而導(dǎo)致HA催化裂解的增強(qiáng)。而蛋白酶對(duì)HA的催化裂解是甲型流感病毒具有傳染性的必要條件。第三，NA可促進(jìn)巨噬細(xì)胞

33、中炎癥前細(xì)胞因子如白介素-1（interleukin-1, IL-1）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）的產(chǎn)生。這些細(xì)胞因子可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的聚集，活化并促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放，直接刺激發(fā)熱中樞進(jìn)而引起全身發(fā)熱，從而引發(fā)流感癥狀及呼吸道炎癥。此外，NA在流感病毒與肺炎鏈球菌的協(xié)同上發(fā)揮著重要作用。繼發(fā)細(xì)菌性肺炎是流感相關(guān)性死亡的一個(gè)重要原因。兩者間協(xié)同作用的可能機(jī)制包括：病毒對(duì)呼吸道上皮的破壞可能增加細(xì)菌的黏附；病毒誘發(fā)的免疫抑制可能導(dǎo)致細(xì)菌的二次感染；病毒感染的炎癥應(yīng)答可能導(dǎo)致作為細(xì)菌受體的分子的上調(diào)表達(dá)。流感病毒和副流感病毒具有NA活性，很可能在病毒孵化后增加

34、細(xì)菌黏附。實(shí)驗(yàn)研究表明，病毒NA通過消除末端的唾液酸來暴露宿主細(xì)胞表面的肺炎球菌受體。其他實(shí)驗(yàn)顯示，病毒NA活性的抑制可減少肺炎鏈球菌的黏附及侵入，且獨(dú)立于對(duì)病毒復(fù)制的影響。相應(yīng)的臨床研究也顯示對(duì)素因性流感病毒感染使用特效神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NAIs）可減少呼吸道二次細(xì)菌感染的發(fā)生率，改善抗生素的效力并增加高危患者的存活率，這些患者都有并發(fā)癥且極易死亡。NA的功能并不是孤立的。先前曾有研究顯示NA活性的缺失甲型流感病毒也能在細(xì)胞、雞蛋或小鼠中歷經(jīng)多次復(fù)制周期。如此看來，在甲型流感病毒的生活周期中NA活性并不是絕對(duì)必需的，但對(duì)于有效的病毒復(fù)制似乎仍是必要的。在流感病毒感染過程中HA與NA之間存在著

35、功能方面的相互作用，更準(zhǔn)確地說，是功能方面的平衡。這兩種表面糖蛋白在受體結(jié)合與受體破壞之間的最佳平衡，是實(shí)現(xiàn)有效病毒復(fù)制所必需的。另外，流感病毒中NA的底物專一性與HA的受體特異性存在著天然相關(guān)。底物專一性分析顯示所有的病毒對(duì)Neu5Ac2-3Gal具有相似的專一性，而對(duì)Neu5Ac2-6Gal的活性則依類型不同而從低到高有所不同。前者以禽病毒和早期的人類N2亞型病毒為代表，后者以豬病毒和近來的人類N2亞型病毒為代表。NA對(duì)2,3-鍵的保守活性很可能為病毒逃避呼吸道黏蛋白的截留所必需，而黏蛋白主要包含包括Sia2,3Gal單元。據(jù)推斷，對(duì)2,6-鍵活性的增加可能導(dǎo)致對(duì)病毒的選擇性優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)為對(duì)

36、細(xì)胞受體更有效的破壞，從而實(shí)現(xiàn)子代病毒顆粒更有效的釋放?？偠灾琋A對(duì)不同底物的個(gè)別適應(yīng)可能有助于流感病毒的傳染。抑制基于免疫機(jī)制的流感病毒NA一直是抗流感藥物研究中的活躍領(lǐng)域。研究表明，抗流感病毒NA的抗體對(duì)流感有防護(hù)作用。隨著體內(nèi)抗流感病毒NA抗體水平的增加，流感病毒引起的呼吸道疾病發(fā)生率下降；而當(dāng)流感病毒出芽和出芽至最大數(shù)目時(shí)，疾病的嚴(yán)重程度與患者體內(nèi)血清中NA抗體水平呈反比。4.1 晶體學(xué)文 - 漢語漢字 編輯詞條文，wen，從玄從爻。天地萬物的信息產(chǎn)生出來的現(xiàn)象、紋路、軌跡，描繪出了陰陽二氣在事物中的運(yùn)行軌跡和原理。故文即為符。上古之時(shí)，符文一體。古者伏羲氏之王天下也，始畫八卦，造

37、書契，以代結(jié)繩(爻)之政，由是文籍生焉。-尚書序依類象形，故謂之文。其后形聲相益，即謂之字。-說文序倉頡造書，形立謂之文，聲具謂之字。-古今通論(1) 象形。甲骨文此字象紋理縱橫交錯(cuò)形。文是漢字的一個(gè)部首。本義:花紋;紋理。(2) 同本義 figure;veins文，英語念為:text、article等，從字面意思上就可以理解為文章、文字，與古今中外的各個(gè)文學(xué)著作中出現(xiàn)的各種文字字形密不可分。古有甲骨文、金文、小篆等，今有宋體、楷體等，都在這一方面突出了文的重要性。古今中外，人們對(duì)于文都有自己不同的認(rèn)知，從大的方面來講，它可以用于表示一個(gè)民族的文化歷史，從小的方面來說它可用于用于表示單獨(dú)的一個(gè)

38、文字，可用于表示一段話，也可用于人物的姓氏。折疊編輯本段基本字義1事物錯(cuò)綜所造成的紋理或形象：燦若錦。2.刺畫花紋：身。3記錄語言的符號(hào)：字。盲。以害辭。4用文字記下來以及與之有關(guān)的：憑。藝。體。典。苑。獻(xiàn)（指有歷史價(jià)值和參考價(jià)值的圖書資料）。采（a文辭、文藝方面的才華；b錯(cuò)雜艷麗的色彩）。5人類勞動(dòng)成果的總結(jié)：化。物。6自然界的某些現(xiàn)象：天。水。7舊時(shí)指禮節(jié)儀式：虛。繁縟節(jié)（過多的禮節(jié)儀式）。8文華辭采，與“質(zhì)”、“情”相對(duì)：質(zhì)彬彬。9溫和：火。靜。雅。10指非軍事的：職。治武功（指禮樂教化和軍事功績）。11指以古漢語為基礎(chǔ)的書面語：552言。白間雜。12專指社會(huì)科學(xué)：科。13掩飾：過飾非。

39、14量詞，指舊時(shí)小銅錢：一不名。15姓。16 皇帝謚號(hào)，經(jīng)緯天地曰文；道德博聞曰文；慈惠愛民曰文；愍民惠禮曰文；賜民爵位曰文；勤學(xué)好問曰文；博聞多見曰文；忠信接禮曰文；能定典禮曰文；經(jīng)邦定譽(yù)曰文；敏而好學(xué)曰文；施而中禮曰文；修德來遠(yuǎn)曰文；剛?cè)嵯酀?jì)曰文；修治班制曰文；德美才秀曰文；萬邦為憲、帝德運(yùn)廣曰文；堅(jiān)強(qiáng)不暴曰文；徽柔懿恭曰文；圣謨丕顯曰文；化成天下曰文；純穆不已曰文；克嗣徽音曰文；敬直慈惠曰文；與賢同升曰文；紹修圣緒曰文；聲教四訖曰文。如漢文帝。折疊編輯本段字源字形字源演變與字形比較折疊編輯本段詳細(xì)字義名1右圖是“文”字的甲骨文圖片，資料來源：徐無聞主編：甲金篆隸大字典，四川辭書出版社。1

40、991年7月第一版?！拔摹弊值募坠俏淖掷L畫的像一個(gè)正面的“大人”，寓意“大象有形”、“象形”；特別放大了胸部，并在胸部畫了“心”，含義是“外界客體在心里面的整體影像、整體寫真、整體素描、整體速寫”。許慎說文解字把“文”解釋為“錯(cuò)畫也”，意思是“對(duì)事物形象進(jìn)行整體素描，筆畫交錯(cuò)，相聯(lián)相絡(luò)，不可解構(gòu)”，這與他說的獨(dú)體為文、合體為字的話的意思是一致的?！罢f文解字”這個(gè)書名就表示了“文”只能“說”，而“字”則可“解”的意思?！拔摹笔强陀^事物外在形象的速寫，是人類進(jìn)一步了解事物內(nèi)在性質(zhì)的基礎(chǔ)，所以它是“字”的父母，“字”是“文”的孩子?！拔摹鄙白帧迸e例（以“哲”為例）：先對(duì)人手摩畫，其文為“手”；又對(duì)

41、斧子摩畫，其文為“斤”。以手、斤為父母，結(jié)合、生子，其子就是“折”（手和斤各代表父母的基因）。這個(gè)“折”就是許慎所謂的“字”?！白帧睆腻矎淖樱板病北硎尽蔼?dú)立的房子”，子在其中，有“自立門戶”的意思。故“字”還能與“文”或其他“字”結(jié)合，生出新“字”來。在本例，作為字的“折”與作為文的“口”結(jié)合，就生出了新的字“哲”。2同本義 figure;veins文，錯(cuò)畫也。象交文。今字作紋。東漢許慎說文五章以奉五色。春秋左丘明左傳昭公二十五年。注：“青與赤謂之文，赤與白謂之章，白與黑謂之黼，黑與青謂之黻?！泵烙陧腠胛恼?。荀子非相茵席雕文。韓非子十過織文鳥章，白旆央央。詩小雅六月斑文小魚。明 劉基誠意伯劉

42、文成公文集3又如：文駕（彩車）；文斑（雜色的斑紋）；文旆（有文彩的旗幟）；文繡（繡有彩色花紋的絲織品；刺花圖案）；文織（有彩色花紋的絲織品）；文鱗（魚鱗形花紋）。4字，文字（“文”，在先秦時(shí)期就有文字的意思，“字”，到了秦朝才有此意。分別講，“文”指獨(dú)體字；“字”指合體字?；\統(tǒng)地說，都泛指文字。） character飾以篆文。南朝宋范曄后漢書張衡傳分文析字。東漢班固漢書劉歆傳夫文，止戈為武。左傳宣公十二年距洞數(shù)百步，有碑仆道，其文漫滅。王安石游褒禪山記文曰“天啟壬戌秋日”。明 魏學(xué)洢核舟記文曰“初平山尺”。5又如：甲骨文；金文；漢文；英文；文跡（文字所記載的事跡）；文書爻（有關(guān)文字、文憑之類的

43、卦象）；文異（文字相異）；文軌（文字和車軌）；文獄（文字獄）；文錢（錢。因錢有文字，故稱）；文狀（字據(jù)，軍令狀）；文引（通行證；路憑）；文定（定婚）。6文章（遣造的詞句叫做“文”，結(jié)構(gòu)段落叫做 “章”。） literary composition故說詩者不以文害辭。孟子萬章上好古文。唐 韓愈師說屬予作文以記之。宋 范仲淹岳陽樓記能述以文。宋 歐陽修醉翁亭記摘其詩文。清 紀(jì)昀閱微草堂筆記7又如：文價(jià)（文章的聲譽(yù)）；文魔（書呆子）；文會(huì)（舊時(shí)讀書人為了準(zhǔn)備應(yīng)試，在一起寫文章、互相觀摩的集會(huì)）；文移（舊時(shí)官府文書的代稱）；文雄（擅長寫文章的大作家）；文意（文章的旨趣）；文義（文章的義理）；文情（文章

44、的詞句和情思）；本文（所指的這篇文章）；作文（寫文章；學(xué)習(xí)練習(xí)所寫的文章）；文魁（文章魁首）；文價(jià)（文章的聲價(jià)）；文什（文章與詩篇）。8美德；文德 virtue圣云繼之神，神乃用文治。杜牧感懷詩一首9又如：文丈（對(duì)才高德韶的老者的敬稱）；文母（文德之母）；文武（文德與武功）；文命（文德教命）；文惠（文德恩惠）；文德（寫文章的道德）；文?。ㄖ^文德淺?。晃恼眩ㄎ牡抡阎?。10.文才；才華。亦謂有文才，有才華 literary talent而文采不表于后世也。漢 司馬遷報(bào)任安書11又如：文業(yè)（才學(xué)）；文英（文才出眾的人）；文采風(fēng)流（橫溢的才華與瀟灑的風(fēng)度）；文郎（有才華的青少年）；文彥（有文才德行的人）；文通殘錦（比喻剩下不多的才華）。12文獻(xiàn)，經(jīng)典；韻文 document;classics;verse儒以文亂法。韓非子五蠹言必遵修舊文而不穿鑿。說文解字?jǐn)?3辭詞句。亦指文字記載 writings;record。如：文幾（舊時(shí)書信中開頭常用的套語。意為將書信呈獻(xiàn)于幾前）；文倒（文句顛倒）；文過其實(shí)（文辭浮夸，不切實(shí)際）；文義（文辭）；文辭（言詞動(dòng)聽的辭令）；文繡（辭藻華麗）。14自然界的某些現(xiàn)象 natural phenomenon經(jīng)緯天地曰文。左傳昭公二十八年