王鏡巖-生物化學(xué)I-第7章 蛋白質(zhì)的分離純化和表征-第8章 酶通論課件

1、Protein第7章 蛋白質(zhì)的分離純化和表征 蛋白質(zhì)含有酸/堿AA殘基具有兩性 堿/酸越大pI 越大pI通常在 6.0 左右一、蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)的分子量 一般在一萬至一百萬道爾頓之間 1道爾頓1C12絕對(duì)質(zhì)量/12 1.6610-27千克二、蛋白質(zhì)分子的大?。ㄒ唬└鶕?jù)化學(xué)組成測(cè)定最小分子量1、測(cè)定蛋白質(zhì)中某一微量元素的含量2、假設(shè)蛋白質(zhì)中僅含一個(gè)鐵原子最低相對(duì)分子質(zhì)量= 100* 55.8/鐵的百分含量（二）SDSPAGE測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)顆粒電泳時(shí)遷移率取決于：所帶電荷分子量分子形狀十二烷基磺酸鈉原態(tài)蛋白質(zhì)變性？磺酸基 極性親水烷基 親油（蛋白質(zhì)疏水區(qū)）遷移率與電荷和形狀

2、無關(guān)，僅取決于相對(duì)分子質(zhì)量巰基乙醇破壞二硫鍵（三）凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量蛋白質(zhì)混合樣凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測(cè)量蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥2.水膜彈性蛋白質(zhì)溶液具有丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)以及不能通過半透膜等性質(zhì)（二）蛋白質(zhì)的沉淀 Pr從膠體溶液中析出 可逆沉淀：溫和條件，改變?nèi)芤簆H或Pr所帶電荷Pr結(jié)構(gòu)和性質(zhì)沒有變化適當(dāng)條件下可重新溶解 非變性沉淀pI沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等 1.鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質(zhì)的水化層，鹽析一般不引起變性等電點(diǎn)沉淀的蛋白質(zhì)溶液中加入NaCl后沉淀溶解鹽溶原因？鹽溶鹽析分子在等電點(diǎn)時(shí)，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后

3、破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質(zhì)會(huì)沉淀析出原因？蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析（NH4）2SO4）2.有機(jī)溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用3.等電點(diǎn)沉淀4.重金屬鹽沉淀 與帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)結(jié)成不溶性鹽5.生物堿試劑和某些酸類沉淀 與帶正電荷蛋白質(zhì)生成不溶性鹽6.加熱變性沉淀 天然結(jié)構(gòu)解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加制品純度或比活1.前處理：因動(dòng)/植物/細(xì)菌而異2.粗分級(jí)分離：采用鹽析/等電點(diǎn)沉淀/有機(jī)溶劑分級(jí)分離等方法3.細(xì)分級(jí)分離：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以

4、及親和層析等4.結(jié)晶血液透析小分子溶出小分子被帶出透析機(jī)透析液加壓血液2、密度梯度（區(qū)帶）離心6000080000轉(zhuǎn)/分重力60萬80萬倍（二）利用溶解度差別的純化方法 1.等電點(diǎn)沉淀 調(diào)整溶液pH 不同蛋白在各自 pI處依次沉淀 2.鹽溶和鹽析3.有機(jī)溶劑分級(jí)分離法降低介電常數(shù)爭(zhēng)奪水化膜（三)根據(jù)電荷不同的分離方法電泳原理：蛋白質(zhì)在非等電點(diǎn)時(shí)所帶總電荷不為0分子大小不同，電場(chǎng)中移動(dòng)速度也不同等電聚焦電泳雙向電泳離子交換層析（四）利用蛋白質(zhì)選擇性吸附的性質(zhì)羥磷石灰層析疏水作用層析（五）利用對(duì)配體的特異生物學(xué) 親和力的純化方法親和色譜顆粒具有極強(qiáng)的專一性六、蛋白質(zhì)含量測(cè)定和純度鑒定（略）第8章

5、酶通論Enzyme酶的發(fā)現(xiàn)及研究歷史人們對(duì)酶的認(rèn)識(shí)起源于生產(chǎn)與生活實(shí)踐。夏禹時(shí)代，人們掌握了釀酒技術(shù)。公元前12世紀(jì)周朝，人們釀酒，制作飴糖和醬。春秋戰(zhàn)國(guó)時(shí)期已知用麴(曲)治療消化不良的疾病。酶者，酒母也酵素的發(fā)現(xiàn) enzyme (in yeast)enzyme是希臘文 en = in ， zyme = yeast什么是酶？酶是生物催化劑生物體一切生化反應(yīng)都需酶催化才能進(jìn)行！性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過人造催化劑定義：由活細(xì)胞產(chǎn)生的、 有高度專一性和 高效催化作用的生物大分子。一、酶催化作用的特點(diǎn) 1. 提高反應(yīng)速度，不改變平衡點(diǎn); 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反應(yīng)的活化能。 （一）與一般催化

6、劑相同的特點(diǎn) 活化能(activation energy) 指在一定溫度下，1mol底物全部進(jìn)入活化態(tài)所需要的自由能 單位：KJ/mol酶催化反應(yīng)的實(shí)質(zhì)：降低反應(yīng)的活化能1. 易失活（溫和性）（二） 生物催化劑的特點(diǎn)常溫、常壓、中性 除個(gè)別RNA為催化自身反應(yīng)的酶外，其余所有的酶都是蛋白質(zhì)。2. 高效性且無副反應(yīng)反應(yīng)速度是無酶催化/普通人造催化劑催化反應(yīng)速度的1061016倍。 酶的催化雙氧水裂解3.專一性Specificity: 酶對(duì)催化的反應(yīng)和反應(yīng)物有 嚴(yán)格的選擇性。底物（Substrate): 酶作用的物質(zhì)。 （1）酶濃度的可調(diào)性 （2）通過激素調(diào)節(jié)酶活性 （3）反饋抑制調(diào)節(jié)酶活性 （4

7、）抑制劑和激活劑 （5）別構(gòu)調(diào)控、共價(jià)修飾、同工酶等 4. 可調(diào)節(jié)性二、酶的化學(xué)本質(zhì)及分類經(jīng)酸堿水解終產(chǎn)物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可變性失活酶是兩性電解質(zhì)具有不能通過半透膜等膠體性質(zhì)具有蛋白質(zhì)的化學(xué)呈色反應(yīng)化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)（一）酶的化學(xué)本質(zhì)1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。 單純酶 ：只有蛋白質(zhì) 結(jié)合酶（綴合酶）：脫輔酶 + 輔助因子輔助因子輔基輔酶與酶結(jié)合緊與酶結(jié)合松全酶（二）酶的化學(xué)組成羧肽酶NADPH脫氫酶的輔酶過氧化氫酶結(jié)合酶中： 單獨(dú)酶蛋白或輔助因子沒有催化活性一種酶蛋白一般只與一種輔助因子結(jié)合同

8、種輔助因子可與不同的酶蛋白結(jié)合 酶蛋白：決定反應(yīng)的專一性輔助因子：傳遞電子、原子或某些 化學(xué)基團(tuán)的作用monomeric enzyme：一般由一條肽鏈組成oligomeric enzyme：為寡聚蛋白，2個(gè)亞基multienzyme complex：幾種酶靠非共價(jià)鍵 彼此嵌合而成。由數(shù)個(gè)獨(dú)立的酶組合起來形成絡(luò)合體，催化一系列反應(yīng)。（如糖代謝、脂代謝）（三）單體酶、寡聚酶、多酶復(fù)合體根據(jù)酶蛋白分子的特點(diǎn)：三、酶的命名和分類（一）習(xí)慣命名法根據(jù)其催化底物來命名；根據(jù)所催化反應(yīng)的性質(zhì)來命名；結(jié)合上述兩個(gè)原則來命名，有時(shí)在這些命名基礎(chǔ)上加上酶的來源或其它特點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn) 命名簡(jiǎn)單應(yīng)用歷史較長(zhǎng)，使用方便缺點(diǎn)一

9、名數(shù)酶、一酶數(shù)名為了適應(yīng)酶學(xué)發(fā)展的新情況，國(guó)際酶學(xué)會(huì)議于1961年提出一個(gè)新的系統(tǒng)命名法及分類原則，已被國(guó)際生化協(xié)會(huì)采用。（二）國(guó)際系統(tǒng)命名法：系統(tǒng)名稱包括底物名稱、反應(yīng)性質(zhì)，最后加一個(gè)酶字。 底物1 ：底物2 + 反應(yīng)性質(zhì)+酶 乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化還原酶當(dāng)?shù)孜餅樗畷r(shí)，可省略 系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化還原酶 慣用名：只取較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。乳酸：NAD+氧化還原酶乳酸脫氫酶對(duì)于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。（三）國(guó)際系統(tǒng)分類編號(hào) 1961年國(guó)際酶

10、學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：氧化-還原酶催化氧化-還原反應(yīng)，催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞。主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸(Lactate)脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化還原酶 OxidoreductaseAH2 + B（O2）A + BH2（H2O2，H2O）（四）六大類酶的特征（1）脫氫酶類：催化直接從底物上脫氫的反應(yīng)AH2 +BA +BH2（需輔酶或輔酶）（2）氧化酶類催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN）催化底物脫氫，氧化生成

11、H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）過氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2（4）加氧酶（雙加氧酶和單加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（順，順-已二烯二酸）RH + O2 + 還原型輔助因子ROH + H2O + 氧化型輔助因子（又稱羥化酶）轉(zhuǎn)移酶催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個(gè)底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個(gè)底物的分子上。根據(jù)X分類：轉(zhuǎn)移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烴基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如， 谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2、轉(zhuǎn)移酶 TransferaseAX + BA +BX水解酶催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂

12、酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH裂合酶催化從底物分子中移去一個(gè)基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括醛縮酶、水化酶及脫氨酶等。例如， 延胡索酸水合酶催化的反應(yīng)。4、裂合酶 Lyase異構(gòu)酶催化各種同分異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，即底物分子內(nèi)基團(tuán)或原子的重排過程。例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)5、異構(gòu)酶 IsomeraseABPP合成酶，又稱為連接酶，能夠催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 鍵的形成反應(yīng)。這類反應(yīng)必須與ATP分解反應(yīng)相互偶聯(lián)。例如，丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng)。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、合

13、成酶 Ligase or SynthetaseA + B + ATPAB + ADP +Pi酶的系統(tǒng)編號(hào)：4位數(shù)字第一位：代表六大類反應(yīng)類型第二位：亞類（作用的基團(tuán)或鍵的特點(diǎn)）第三位：亞亞類（精確表示底物/產(chǎn)物的性質(zhì)）第四位：在亞亞類中的序號(hào)乳酸脫氫酶 EC 1. 1. 1. 27第1大類，氧化還原酶第1亞類，氧化基團(tuán)CHOH第1亞亞類，H受體為NAD+該酶在亞亞類中的編號(hào)指酶對(duì)底物的選擇性，也稱特異性。結(jié)構(gòu)專一性立體異構(gòu)專一性絕對(duì)專一性相對(duì)專一性族專一性鍵專一性旋光異構(gòu)專一性幾何異構(gòu)專一性四、酶的專一性（一）酶的專一性（1）鎖鑰學(xué)說剛性構(gòu)象（2）誘導(dǎo)契合學(xué)說（3）結(jié)構(gòu)性質(zhì)互補(bǔ)學(xué)說 靜電效應(yīng)、

14、極性相同（4）三點(diǎn)附著學(xué)說 立體異構(gòu)專一性的酶（二）與酶專一性有關(guān)的學(xué)說鎖鑰學(xué)說認(rèn)為整個(gè)酶分子的天然構(gòu)象是具有剛性結(jié)構(gòu)的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結(jié)合如同一把鑰匙對(duì)一把鎖一樣誘導(dǎo)契合學(xué)說酶表面并沒有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀. （Koshland，1958）：當(dāng)?shù)孜锖兔附佑|時(shí)，可誘導(dǎo)酶分子的構(gòu)象變化，使酶活性中心的各種基團(tuán)處于和底物互補(bǔ)契合的正確空間位置，有利于催化。羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式“三點(diǎn)結(jié)合”的催化理論酶與底物的結(jié)合處至少有三個(gè)點(diǎn)，而且只有一種情況是完全結(jié)合的形式。只有這種情況下，不對(duì)稱催化作用才能實(shí)現(xiàn)。（一） 酶活力與酶促反應(yīng)速度 酶活力就是

15、酶催化反應(yīng)的能力 能催化多快的反應(yīng) 通常以測(cè)出的酶促反應(yīng)速度表示 五、酶的活力測(cè)定和分離純化單位時(shí)間內(nèi)底物的減少或產(chǎn)物的增加1. 酶促反應(yīng)速度的測(cè)定方法產(chǎn)物濃度變化曲線用哪一個(gè)速度來表示酶促反應(yīng)的速度特征呢？反應(yīng)初速度 Vo反應(yīng)初速度表示酶活力2.活力單位 (U) 酶單位（U）： 在一定條件下、一定時(shí)間內(nèi)、將一定量的 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。如： 每小時(shí)催化1克底物 每小時(shí)催化1ml某濃度溶液 每分鐘催化1ug底物一定時(shí)間一定量底物一定條件下 在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ，最適pH和最適底物濃度）一分鐘內(nèi)催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 IU= 1 mol / min 酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（1

16、）國(guó)際單位（IU） 在標(biāo)準(zhǔn)條件下（25 ，最適pH和最適底物濃度）每秒鐘催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 1 Kat =1 mol/s = 60106 IU酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)化（2）Kat每mg酶蛋白所含的酶活力單位數(shù)。 u/mg酶蛋白酶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常使用，一定程度上代表酶的純度。（3）比活力 (specific activity)一定條件下：每秒鐘、每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換的底物分子數(shù)或每微摩爾酶分子轉(zhuǎn)換底物的微摩爾數(shù)一秒內(nèi)1摩爾的酶可催化幾摩爾的底物 （4）轉(zhuǎn)換數(shù)（turnover number）酶活力測(cè)定實(shí)例確定反應(yīng)條件 20、pH=7，底物濃度 6g/l（過量）， 加入2mg固體脂肪酶確定活力

17、單位 每小時(shí)催化1克底物 1u= 1g/h 測(cè)反應(yīng)初速度 作產(chǎn)物甘油隨時(shí)間增加的曲線， 量出反應(yīng)初速度值 ， 換算為脂肪的消耗速度。如 8g/h換算活力 8g/h / 1g/h=8u計(jì)算比活 8u/2mg酶蛋白=4u/mg酶蛋白脂肪脂肪酶甘油 + 脂肪酸 測(cè)定完成一定反應(yīng)所需的時(shí)間 測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)酶催化的化學(xué)反應(yīng)量（1）分光光度法： 利用底物/產(chǎn)物光吸收性質(zhì)不同 選擇適當(dāng)波長(zhǎng)來測(cè)定。（2）熒光法： 利用底物/產(chǎn)物熒光性質(zhì)的差別。紫外/可見光3. 酶活力的測(cè)定方法（3）同位素測(cè)定方法： 放射性同位素標(biāo)記底物， 經(jīng)酶作用得到相應(yīng)產(chǎn)物， 經(jīng)適當(dāng)分離，測(cè)定產(chǎn)物脈沖數(shù)即可。（4）電化學(xué)法： 包括pH測(cè)定

18、法，離子選擇電極法等。 前者跟蹤反應(yīng)過程中H+的變化， 后者用氧電極測(cè)定一些耗氧的酶反應(yīng)。（二）酶的分離和純化衡量分離提純效果的兩個(gè)指標(biāo)：總活力的回收是表示提純過程中酶的損失情況比活力提高的倍數(shù)是表示提純方法的有效程度分離純化方法同蛋白質(zhì)純化類似：1.選材：酶含量豐富的新鮮生物材料2.破碎：因材料而異3.抽提：低溫下以水或低鹽緩沖液抽提4.分離及純化：粗分級(jí)，細(xì)分級(jí)分離5. 結(jié)晶6.保存：低溫下酶粉可長(zhǎng)期保存注意低濃度酶溶液易變性酶的制備過程中，每步都應(yīng)進(jìn)行鑒定常用的鑒定指標(biāo)為：回收率每次總活力100 /第一次總活力純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力 產(chǎn)率酶的純度鑒定：聚丙烯酰胺凝膠電泳法等電

19、聚焦電泳法六、核酶（ribozyme)（一）核酶：具有催化活性的RNA (1) 1982年，Cech首先發(fā)現(xiàn)四膜蟲 L19RNA既有RNA酶活性，又有 RNA聚合酶活性。 隨后的研究表明： L19RNA具備酶促催化的幾個(gè)特征： 高度的底物專一性 遵循Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué) 對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的敏感性 (2) 1992年，Piccirilli等發(fā)現(xiàn)L19RNA具有氨酰酯酶的活性，催化氨酰酯水解。 (3) L19RNA還有限制性內(nèi)切酶作用： -CpUpCpUpN- + G -CpUpCpU +GpN (4) 1997年，Zhang和Cech用人造的RNA分子催化合成了肽鏈，表明RNA具

20、有肽基轉(zhuǎn)移酶活性。 (5) 原核生物RNaseP和 兔肌1，4- -葡聚糖分枝酶均包括RNA+蛋白組分，起催化作用的都是RNA。（二）核酶的種類（自我催化） 自我剪切： 是轉(zhuǎn)錄后加工方式之一 （self- cleavage） 自我剪接 （self-splicing） 需要鳥苷和Mg2+參與不需要鳥苷的參與剪切與連接催化分子內(nèi)反應(yīng)核酶的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 三個(gè)螺旋 13個(gè)保守堿基 剪切點(diǎn)：GUN RNA既能攜帶遺傳信息 又有生物催化功能。RNA可能早于蛋白質(zhì)和DNA， 是生命起源中首先出現(xiàn)的生物大分子 切割癌基因、致病病毒基因（三）核酶的研究意義與應(yīng)用前景是具有催化作用的抗體本質(zhì)是免疫球蛋白 在易變區(qū)被賦予酶的屬性， 又被稱為催化性抗體?；鶓B(tài)底物過渡態(tài)底物七、抗體酶（abzyme)第一代抗體酶 （過渡態(tài)底物的抗體） 1986年，Schultz與Lerner同時(shí)得到了具有催化活性的抗體； 第二代抗體酶 （引入法） 將催化基團(tuán)及輔助因子引入到抗原抗體結(jié)合部位。第三代抗體酶 （拷貝法） 酶 抗體 抗抗體酶工程：酶制劑在工業(yè)上的大規(guī)模生產(chǎn)及應(yīng)用。 普通酶工程、化學(xué)酶工程、生物酶工程普通酶工程 單純生物提取化學(xué)酶工程1、微生物發(fā)酵得到粗酶2、對(duì)天然酶進(jìn)行化學(xué)修飾、固定化處理， 利用化學(xué)合成等手段來改善酶