化學(xué)生物學(xué)化學(xué)物質(zhì)與酶市公開(kāi)課獲獎(jiǎng)?wù)n件

1、第七章化學(xué)物質(zhì)與酶互相作用第1頁(yè)第1頁(yè)自然界中發(fā)覺(jué)酶已達(dá)3000各種，并且這個(gè)數(shù)目伴隨基因工程和蛋白質(zhì)工程方面研究發(fā)展而大大增長(zhǎng)。酶能夠直接作為藥物用于醫(yī)藥工業(yè)，如溶菌酶可治療各類炎癥，如咽喉炎、口腔潰瘍、慢性鼻炎、帶狀疤疹及各種刀傷引起發(fā)炎等，天冬酞胺酶治療癌癥，治療血栓尿激酶等。酶也廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)工業(yè)等，在臨床檢查、生物分析等領(lǐng)域也廣泛使用。第2頁(yè)第2頁(yè)另外，每種酶都有一定克制劑，這類克制劑能夠參與生物代謝過(guò)程化學(xué)調(diào)控，因此有些酶克制劑也許屬于毒物，而有些克制劑能夠作為藥物使用。酶克制劑作為新藥尋找與開(kāi)發(fā)，在近一、二十年來(lái)分子生物學(xué)發(fā)展基礎(chǔ)上得以實(shí)用化。化

2、學(xué)物質(zhì)（無(wú)機(jī)物質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)和高分子物質(zhì)）與酶互相作用包括化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶激活作用、克制作用、改性作用和酶對(duì)化學(xué)物質(zhì)催化作用等。第3頁(yè)第3頁(yè)第一節(jié) 化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶克制作用凡能降低酶促反應(yīng)速度作用，稱為酶克制作用。能使酶活性受克制物質(zhì)，稱為酶克制劑。近年來(lái)對(duì)酶克制作用研究進(jìn)展快速。因?yàn)榻?jīng)過(guò)酶克制作用研究，不但對(duì)了解酶專性，酶活性部位物理和化學(xué)結(jié)構(gòu)，酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)以及酶作用機(jī)制等；而且對(duì)了解藥品和毒物作用于機(jī)體方式及機(jī)理等也有主要意義；對(duì)代謝路徑中酶調(diào)整也能提供信息。克制劑之因此能克制酶促反應(yīng)，主要是因?yàn)樗鼈兡苁姑副匦杌蚧蚧钚圆课恍再|(zhì)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而造成酶活性降低或喪失。按克制劑作用方式不同，酶克制作

3、用可分為可逆和不可逆兩種類型。 第4頁(yè)第4頁(yè)一、可逆克制作用按可逆克制劑對(duì)酶底結(jié)合影響不同，可分為許多類型，它們反應(yīng)歷程可用一通式表示： 第5頁(yè)第5頁(yè)速度方程通式依據(jù)此反應(yīng)歷程,依據(jù)快速平衡學(xué)說(shuō)或恒態(tài)學(xué)說(shuō)推導(dǎo)，得到其總速度方程通式下列在不同克制作用中，僅在于Ki和Ki兩個(gè)數(shù)值不同，普通可分為4種類型：即競(jìng)爭(zhēng)性克制、非競(jìng)爭(zhēng)性克制、反競(jìng)爭(zhēng)性克制和混合性克制。 將該方程作雙倒數(shù)處理，可得第6頁(yè)第6頁(yè)1，競(jìng)爭(zhēng)性克制作用競(jìng)爭(zhēng)性克制作用中I只與自由酶結(jié)合，因而制止S與酶結(jié)合。而S又不能與EI結(jié)合，I也不能與ES結(jié)合，因此EIS不存在；EI亦不能分解成產(chǎn)物。 第7頁(yè)第7頁(yè)個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性克制劑只增長(zhǎng)酶底結(jié)合表現(xiàn)Km

4、(Kmapp)，即I濃度增長(zhǎng)，Kmapp就增長(zhǎng)；而Vmax則保持不變。在競(jìng)爭(zhēng)性克制劑存在下, 要達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax，必須加入更高底物濃度。如S100Km時(shí)，Vmaxi可達(dá)Vmax。競(jìng)爭(zhēng)性克制劑對(duì)酶促反應(yīng)克制程度，決定于I，S，Km和Ki大小。I一定，增長(zhǎng)S, 減少克制程度；S一定，增長(zhǎng)I，增長(zhǎng)克制程度，Ki值較低時(shí)，任何給定I和S，克制程度都較大；Km值越低，在一定S、I下，克制程度越小。 第8頁(yè)第8頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)性克制作用雙倒數(shù)圖 第9頁(yè)第9頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)性克制作用Ki求解 從雙倒數(shù)圖計(jì)算出表觀米氏常數(shù)Kmapp，然后代入Kmapp=Km(1+I/Ki)可計(jì)算出Ki。從雙倒數(shù)圖求得各I濃度下Kmapp

5、值對(duì)對(duì)應(yīng)I再作圖，從再制圖縱截距可直接測(cè)得Km，從其橫截距可直接測(cè)得Ki。從不同固定I下所作一簇直線斜率1/S對(duì)對(duì)應(yīng)I再制圖，其縱截距為Km/Vmax, 斜率為Km/VmaxKi，橫截距即為-Ki。 第10頁(yè)第10頁(yè)Dixon作圖法求Ki 第11頁(yè)第11頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)性克制劑IC50值 取決于試驗(yàn)所用酶和底物濃度，當(dāng)酶濃度固定期，IC50值與Ki、Km和底物濃度S呈下列關(guān)系：依據(jù)該方程式，當(dāng)?shù)孜餄舛炔恍∮贙m值時(shí)，IC50值高于Ki值，尤其當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，Ki值偏低愈加明顯。 第12頁(yè)第12頁(yè)第13頁(yè)第13頁(yè)競(jìng)爭(zhēng)性克制劑結(jié)構(gòu)特性 底物類似物由于人們對(duì)一個(gè)酶所催化底物性質(zhì)理解比較多，因此，經(jīng)常利用酶底

6、物類似物作為競(jìng)爭(zhēng)性克制劑研究一些三維結(jié)構(gòu)不清楚酶活性中心結(jié)構(gòu)。另外，也能夠依據(jù)底物結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)一些臨床上使用藥物。 第14頁(yè)第14頁(yè)比如， -葡糖苷酶克制劑如阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖（voglibose）和米格列醇（Miglitol）第15頁(yè)第15頁(yè)黃嘌呤氧化酶催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，進(jìn)而被氧化成尿酸，黃嘌呤氧化酶克制劑-別嘌呤醇治療痛風(fēng)病就是通過(guò)克制黃嘌呤氧化酶，減少尿酸生物合成。 第16頁(yè)第16頁(yè)過(guò)渡態(tài)類似物酶催化化學(xué)反應(yīng)效率高原因在于酶能與高能態(tài)過(guò)渡態(tài)相結(jié)合，從而大大減少了化學(xué)反應(yīng)活化能。假如對(duì)催化某一特定生物化學(xué)反應(yīng)酶三維結(jié)構(gòu)尚不清楚，能夠依據(jù)其生化反應(yīng)過(guò)程，設(shè)計(jì)合成

7、含有特定結(jié)構(gòu)、疏水性匹配、電子和空間原因與過(guò)渡態(tài)類似穩(wěn)定化合物，作為該酶特異克制劑，這無(wú)疑為藥物合理分子設(shè)計(jì)提供了另一強(qiáng)有力手段。 第17頁(yè)第17頁(yè)比如，乙酰膽堿酯酶(AChE)羥基與酯酶酯解部位形成共價(jià)鍵，其四價(jià)氮上強(qiáng)正電荷與酯酶陰離子部位呈靜電聯(lián)接。酶乙?；痪迷斐甚ユI斷裂和膽堿消除，乙?；鸽S后與水反應(yīng)而使酶再生并放出乙酸。氨基甲酸酯殺蟲(chóng)劑是乙酰膽堿酯酶水解過(guò)渡態(tài)穩(wěn)定類似物，能與乙酰膽堿酯酶結(jié)合部位緊密結(jié)合而克制乙酰膽堿酯酶。 第18頁(yè)第18頁(yè)又如苯甲酰丙氨醛是胰凝乳蛋白酶過(guò)渡態(tài)克制劑，其結(jié)構(gòu)類似底物苯甲酰苯丙氨?；衔锱c酶形成共價(jià)中間物中底物酰基部分，比底物中肽鍵羰基更易受到酶活性中心

8、羥基親核攻打，但不能形成?；腹矁r(jià)中間物。 第19頁(yè)第19頁(yè)其它化合物 有些化合物平面結(jié)構(gòu)與底物并不相同，但立體構(gòu)象十分相近，也能夠成為競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。非甾體抗炎藥是一類含有不同結(jié)構(gòu)類型化合物，因?yàn)檫x擇性地克制環(huán)氧合酶活性，用作抗炎止痛藥。環(huán)氧合酶克制劑消炎痛和底物花生四烯酸三維結(jié)構(gòu)，整個(gè)分子立體構(gòu)象中，羧基和雙鍵配置有某種相同性，因而競(jìng)爭(zhēng)性地與環(huán)氧合酶結(jié)合。第20頁(yè)第20頁(yè)塞來(lái)克西(Celebrex)作為環(huán)氧合酶（COX2，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生酶）特異性克制劑，難以進(jìn)入開(kāi)口較小COX1活性中心通道，故而不能對(duì)其產(chǎn)生克制作用，但仍能進(jìn)入口徑稍大，后段略有柔性COX2通道，而能對(duì)COX2產(chǎn)生克制作用。第2

9、1頁(yè)第21頁(yè)一些競(jìng)爭(zhēng)性克制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)沒(méi)有任何關(guān)系，其克制作用原理是克制劑與一些酶活性中心金屬離子絡(luò)合，阻礙了底物進(jìn)入，從而起到克制酶活性目的。比如5-脂氧合酶(LOX)活性中心含有一個(gè)非血紅素鐵原子，通過(guò)Fe2+與Fe3+循環(huán)實(shí)現(xiàn)其催化功效。該酶一些克制劑（CGS-23885,A-76745）就是通過(guò)鐵螯合而與底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶活性中心結(jié)合。 第22頁(yè)第22頁(yè)2，非競(jìng)爭(zhēng)性克制作用 經(jīng)典非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑不影響酶-底物結(jié)合；底物也不影響酶-I結(jié)合；S和I都可可逆獨(dú)立地結(jié)合于酶不同部位上；而且ESI為端點(diǎn)復(fù)合物。 第23頁(yè)第23頁(yè)非競(jìng)爭(zhēng)性克制作用雙倒數(shù)方程第24頁(yè)第24頁(yè)非競(jìng)爭(zhēng)性克制作用Ki

10、求解 從I0和I為某一固定濃度所作1/對(duì)1/S雙倒數(shù)圖縱截距可直接測(cè)得1/Vmax和(1/Vmax)(1+I/Ki)，從而計(jì)算出Ki。從不同固定I所作雙倒數(shù)圖斜率1/S對(duì)I再制圖可求得Ki。從不同固定I所作雙曲數(shù)圖縱截距對(duì)I再制圖，從其橫截距可直接到得Ki。 第25頁(yè)第25頁(yè)Dixon作圖法求Ki 第26頁(yè)第26頁(yè)非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑IC50值 非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑IC50值與底物濃度關(guān)系下列：依據(jù)該式，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，IC50值靠近于Ki值；當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，IC50值明顯低于Ki值。 第27頁(yè)第27頁(yè)非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑結(jié)構(gòu)特性 由于非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑并非結(jié)合于酶活性中心底物結(jié)合位點(diǎn)，而是活性中心附近一些區(qū)域

11、或基團(tuán)，不影響酶與底物親和力。而非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑作用部位不是十分清楚，因此，不能依據(jù)酶底物及酶活性中心結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。當(dāng)前所發(fā)覺(jué)一些酶非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑大多數(shù)都是隨機(jī)篩選得到化合物。 第28頁(yè)第28頁(yè)比如，染料木素（genistein）對(duì)于-葡萄糖苷酶克制作用就是非競(jìng)爭(zhēng)性克制作用。他克林(tacrine)是治療老年癡呆癥乙酰膽堿酯酶非競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。 第29頁(yè)第29頁(yè) 3，反競(jìng)爭(zhēng)性克制作用反競(jìng)爭(zhēng)性克制劑I不能與自由酶結(jié)合，而只能與ES可逆結(jié)合生成不能分解成產(chǎn)物EIS。這一點(diǎn)與競(jìng)爭(zhēng)性克制相反，Ki值為，EIS只能解離成ES + I，而不能解離成EI + S。 第30頁(yè)第30頁(yè)反競(jìng)爭(zhēng)性克制程度取決

12、于I、S、Ki和Km等。它克制程度隨底物濃度增長(zhǎng)而增長(zhǎng)。反競(jìng)爭(zhēng)性克制劑使酶Km值減少，即KmappKm。從這點(diǎn)看，反競(jìng)爭(zhēng)性克制劑不是一個(gè)克制劑，而像是一個(gè)激活劑。它之因此造成對(duì)酶促反應(yīng)克制作用，完全是由于它使Vmax減少而引起。因此假如S很小，反應(yīng)主要為一級(jí)反應(yīng)，則克制劑對(duì)Vmax影響幾乎完全被對(duì)Km相反影響所抵消。這時(shí)幾乎看不到克制作用。 第31頁(yè)第31頁(yè)反競(jìng)爭(zhēng)性克制作用雙倒數(shù)方程 第32頁(yè)第32頁(yè)反競(jìng)爭(zhēng)性克制劑結(jié)構(gòu)特性 反競(jìng)爭(zhēng)性克制在單底物酶催化反應(yīng)中比較少見(jiàn)胎盤(pán)堿性磷酸酯酶以葡萄糖-6-磷酸或-萘酚磷酸酯為底物時(shí)，L-苯丙氨酸為反競(jìng)爭(zhēng)性克制劑；順鉑對(duì)乙酰膽堿酯酶克制作用也是屬于反競(jìng)爭(zhēng)類型

13、。 第33頁(yè)第33頁(yè)在雙底物反應(yīng)中，反競(jìng)爭(zhēng)性克制比較多見(jiàn)，如乒乓機(jī)制酶促反應(yīng)時(shí)，由于I能夠與EB復(fù)合物結(jié)合，對(duì)一個(gè)底物（A）表現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性克制化合物（I）對(duì)另一個(gè)底物（B）呈現(xiàn)反競(jìng)爭(zhēng)性克制。如抗壞血酸對(duì)兔肌乳酸脫氫酶克制作用，抗壞血酸相對(duì)于NADH表現(xiàn)為乳酸脫氫酶反競(jìng)爭(zhēng)克制，相對(duì)于丙酮酸為乳酸脫氫酶競(jìng)爭(zhēng)性克制劑。 第34頁(yè)第34頁(yè) 4，混合性克制作用混合性克制作用中S和E或EI都能夠結(jié)合，I也可和E或ES結(jié)合，但親和力都不相等，表明S和I對(duì)酶結(jié)合互有影響， Ki和Ki兩者既不等于無(wú)窮大，又互不相等，Ksi和Ks也不相等。相關(guān)可逆克制作用通式就是混合性克制作用公式。 第35頁(yè)第35頁(yè)當(dāng)用雙倒數(shù)方程作

14、圖時(shí)，有克制劑和無(wú)克制劑直線既不平行，又不相交于縱軸或橫軸，而是相交于橫軸負(fù)側(cè)上方（第二象限）或下方（第三象限） 第36頁(yè)第36頁(yè)二、不可逆克制作用這類克制作用克制劑與酶分子上某基團(tuán)以牢固共價(jià)健結(jié)合使酶失活。不能用透析、超濾等物理辦法除去克制劑而使酶復(fù)活。不可逆克制作用特點(diǎn)是隨時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)逐步地增長(zhǎng)克制，最后達(dá)到完全克制。 第37頁(yè)第37頁(yè) 1，非專一性不可逆克制作用(1)?；瘎?可用通式表示為RCOX。比如，醋酸酐、三氟乙酸硫醇酯、乙酰咪唑等。它們對(duì)酶?；磻?yīng)下列式： 第38頁(yè)第38頁(yè)磷酰化劑亦屬這類，如二異丙氟磷酸酯(DFP)以及1605、1059等有機(jī)磷酸農(nóng)藥以及神經(jīng)毒劑。DFP能使乙酰膽

15、堿酯酶分子中一個(gè)絲氨酸側(cè)鏈(Ser-CH2OH)磷酸化而使酶失活。 第39頁(yè)第39頁(yè)(2)烴基化劑可用通式R-X表示。如鹵烴衍生物，由于鹵原子強(qiáng)電負(fù)性，使烴基帶部分正電荷，有助于酶上一些親核基團(tuán)襲擊，反應(yīng)下列式： 第40頁(yè)第40頁(yè)(3)含活潑雙鍵試劑含活潑雙鍵試劑，如N-乙基順丁烯二酰亞胺、丙烯氰等，它們可與酶分子上-SH、-NH2等基團(tuán)起加成反應(yīng)，下列式： 第41頁(yè)第41頁(yè)(4)親電試劑常見(jiàn)有四硝基甲烷，它可使酶分子上酪氨酸側(cè)鏈硝基化。產(chǎn)物含有特殊光譜性質(zhì)，易于被檢測(cè)。反應(yīng)下列式： 第42頁(yè)第42頁(yè)2，指向活性部位克制劑 指向活性部位克制劑作用特性是, 克制劑分子中含有化學(xué)活潑功效基，它與酶

16、活性部位處基團(tuán)或原子發(fā)生共價(jià)結(jié)合，使酶失活。這類克制劑通常是在物物分子所特有辨認(rèn)基團(tuán)上連接或修飾有反應(yīng)活性化學(xué)基團(tuán)或原子，當(dāng)克制劑與酶形成初始可逆性復(fù)合物后，該反應(yīng)活性功效基與酶活性中心發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，以致改變了酶氨基酸殘基排布(構(gòu)象)而失活 第43頁(yè)第43頁(yè)引入化學(xué)活性基團(tuán)有鹵代酰基，鹵代酮、偶氮嶺甲基酮、環(huán)氧基、亞磺酰氟、不飽和鍵、二硫鍵、光敏基團(tuán)等。這類克制劑與酶反應(yīng)速率應(yīng)比類似非酶性反應(yīng)快，比如，含有較好拜別基團(tuán)有機(jī)磷化合物對(duì)絲氨酸蛋白酶不可逆克制作用是由于在活性部位絲氨酸處發(fā)生磷?；?，生成磷?；?。這些克制劑并非單純活潑磷?；噭捎谒鼈儗?duì)于親核試劑反應(yīng)活性并不高。比如，

17、對(duì)絲氨酸蛋白酶和乙酰膽堿酯酶磷酰化速率比與水反應(yīng)速率快108-1012倍。 第44頁(yè)第44頁(yè)3，酶自殺性底物克制作用 這類克制劑呈現(xiàn)其活性是在酶催化過(guò)程實(shí)現(xiàn)。這類克制劑結(jié)構(gòu)與底物有很大相同性，與酶分子有較高親和力，它本身無(wú)化學(xué)活性或者沒(méi) 有化學(xué)活性基團(tuán)， 但在酶催化作用 下，產(chǎn)生了化學(xué)活 性親電性基團(tuán)， 從而與酶活性部位 處親核性基團(tuán)發(fā)生 不可逆結(jié)合反應(yīng)， 使酶失活。 第45頁(yè)第45頁(yè)自殺性底物含有下列結(jié)構(gòu)特性和性能(1)同正常底物化學(xué)結(jié)構(gòu)含有相同性；(2)能夠同酶結(jié)合成復(fù)合物，有較大親和力；(3)在通常狀態(tài)下，有低反應(yīng)性能或化學(xué)惰性基團(tuán)或結(jié)構(gòu)片斷；(4)在酶催化階段，可將惰性基團(tuán)轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性

18、能強(qiáng)中間體；(5)與酶活性部位發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，尤其是共價(jià)鍵合，使酶不可逆失活。 第46頁(yè)第46頁(yè)酶自殺性底物功效基團(tuán)類型 第47頁(yè)第47頁(yè)酶自殺性底物特異性是基于它與正常底物結(jié)構(gòu)相同性、這是酶與該克制劑結(jié)合成復(fù)合物并經(jīng)催化反應(yīng)暴露出活性基團(tuán)前提。所暴露出反應(yīng)活性基團(tuán)大多是親電基團(tuán)。比如,不飽和羰基(醛、酮、亞胺或酯等)，與酶分子親核基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng) 第48頁(yè)第48頁(yè),不飽和羰基產(chǎn)生是酶催化反邁克爾加成，生成負(fù)碳型中間體被負(fù)電性羰基共振穩(wěn)定化，使鄰位碳發(fā)生消去反應(yīng)或去質(zhì)子化，生成鄰位不飽和鍵。 第49頁(yè)第49頁(yè)四種類型可逆克制比較 不同類型可逆克制作用能夠利用雙倒數(shù)作圖法來(lái)區(qū)分，依據(jù)圖中有沒(méi)

19、有克制劑時(shí)直線是否相交于1/S軸，還是1/V軸就能夠區(qū)分。第50頁(yè)第50頁(yè) 表7-1 四類可逆克制劑動(dòng)力學(xué)比較克制類型速率方程表觀Km表觀 Vmax無(wú)克制KmVmax競(jìng)爭(zhēng)性增大不變非競(jìng)爭(zhēng)性不變減小反競(jìng)爭(zhēng)性減小減小混合性減小或增大減小第51頁(yè)第51頁(yè)第二節(jié) 化學(xué)物質(zhì)對(duì)酶激活作用 有些化學(xué)物質(zhì)作用與克制劑作用相反，對(duì)酶起著激活作用，加強(qiáng)酶作用效果。在一些情況下，只有在激活劑存在下，酶催化反應(yīng)才干進(jìn)行，或者說(shuō)只有在激活劑存在下催化反應(yīng)速度才干測(cè)得出來(lái)。但凡能提升酶活性物質(zhì)，都稱為激活劑，激活劑普通是無(wú)機(jī)離子活簡(jiǎn)樸有機(jī)化合物，而高分子物質(zhì)較少。第52頁(yè)第52頁(yè)激活劑激活機(jī)制激活劑之因此能夠提升酶催化活

20、性，其主要原因有兩種：一是激活劑與酶分子結(jié)合，改變了酶活性中心及其附近構(gòu)象，從而增強(qiáng)了酶與底物親合能力，或者是增長(zhǎng)了產(chǎn)物拜別速度，進(jìn)而提升酶催化活力；二是激活劑與底物分子結(jié)合再與酶分子結(jié)合，使底物分子電子密度或分子張力發(fā)生改變，有助于產(chǎn)物形成，從而提升酶催化活力。第53頁(yè)第53頁(yè)一、激活劑類型 激活劑類型除了在生物體內(nèi)起激活作用蛋白質(zhì)分子（如酶原激活）以外，按照分子大小能夠分為三種類型。即：無(wú)機(jī)離子、有機(jī)分子和高分子物質(zhì)。第54頁(yè)第54頁(yè)1，含有巰基還原劑 半胱氨酸、2-巰基乙醇和還原型谷胱甘肽等都含有巰基，能夠使酶分子中被氧化-SH基還原，從而提升酶催化活力。如半胱氨酸、2-巰基乙醇和還原型

21、谷胱甘肽等對(duì)腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、木瓜蛋白酶、蠟樣芽胞桿菌蛋白酶、D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶等均含有激活作用。半胱氨酸 (20mM)、2-巰基乙醇(10mM)和谷胱甘肽 (10mM)分別使未活化腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性提升1.3、3.5和2.8倍。 第55頁(yè)第55頁(yè)巰基配位作用這些含有巰基化合物還能夠作為金屬酶活性中心軸向配體從而激活酶催化作用，如巰基苯甲酸、巰基乙酸、半胱氨酸對(duì)細(xì)胞色素 P450、過(guò)氧化氫酶激活作用。過(guò)氧化氫酶被巰基乙酸激活后，其km值減小、kcat/km增大，即巰基乙酸能夠提升過(guò)氧化氫酶對(duì)底物親和力及底物專一性。巰基乙酸同樣能夠引起過(guò)氧化氫酶可見(jiàn)光譜藍(lán)移及酶分子

22、色氨酸殘基熒光強(qiáng)度減小，從而使過(guò)氧化氫酶活性中心鐵卟啉周圍環(huán)境發(fā)生改變，以達(dá)到提升酶活力之目的。第56頁(yè)第56頁(yè)2，多羥基化合物 多羥基化合物如甘油、乙二醇、糖類物質(zhì)等不但能夠作為酶穩(wěn)定劑使用，并且它們對(duì)許多酶含有激活作用。比如，在 Mg2+ 或 Mn2+ 存在情況下，蔗糖對(duì)天冬氨酸酶含有較強(qiáng)激活作用，天冬氨酸酶催化活力同不加蔗糖時(shí)相比可提升5.18倍，同樣當(dāng)甘油加入含酶體系，酶活力有一定程度提升。這種激活作用也許與甘油和蔗糖羥基相關(guān)，且這種激活作用必須與Mg2+或 Mn2+離子結(jié)合起來(lái)才干發(fā)揮作用。 第57頁(yè)第57頁(yè)另外，對(duì)腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶起激活作用物質(zhì)除了半胱氨酸、2-巰基乙醇和

23、還原型谷胱甘肽等以外，3-磷酸甘油是其最有效激活劑。用0.1mol/L 3-磷酸甘油作為激活劑可使腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶Vmax提升近4倍。3-磷酸甘油對(duì)腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶激活取決于3-磷酸甘油與腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶巰基結(jié)合和環(huán)境值。氧化或除去巰基，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性明顯下降；在只有3-磷酸甘油作為腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶激活因子情況下,對(duì)3-磷酸甘油有很大影響，在pH值為7.5、8.0、8.5和9.0時(shí), 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性分別提升了3.1、2.9、4.8和9.5倍。第58頁(yè)第58頁(yè)乙二醇在0.33mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)-葡萄糖醛酸苷酶含有激活作用

24、，其最適濃度為1.5mol/L。其激活機(jī)理也許是由于乙二醇與底物水解產(chǎn)物-葡萄糖醛酸形成苷式結(jié)合，減少了產(chǎn)物克制效應(yīng)，從而提升了酶促反應(yīng)，使酶活性升高。 第59頁(yè)第59頁(yè)3，變性劑 一些變性劑如脲、鹽酸胍等能夠完全破壞酶蛋白空間構(gòu)象，使酶失去活性。但是當(dāng)變性劑濃度較低時(shí)，酶蛋白僅僅發(fā)生了部分變性。由于酶活性中心附近多肽鏈柔性，部分變性使活性中心空間構(gòu)象發(fā)生改變，有助于底物結(jié)合以及產(chǎn)物拜別，從而使酶催化活性提升。第60頁(yè)第60頁(yè)比如，在5C、20C、30C，雞肝二氫葉酸還原酶伴隨鹽酸胍濃度增長(zhǎng)而增高，線經(jīng)歷一個(gè)激活過(guò)程后，再開(kāi)始失活。2mol/L脲可使二氫葉酸還原酶活力提升3.6倍，并且酶活力能

25、夠穩(wěn)定12小時(shí)。4mol/L脲可使二氫葉酸還原酶催化活力提升大約5倍，但激活后酶不久失去活力。 曲線1和2是在脲加入后馬上檢測(cè)，曲線3和4是在脲加入12小時(shí)后檢測(cè) 第61頁(yè)第61頁(yè)一樣不同濃度脲和鹽酸胍也能夠激活腺苷酸激酶，當(dāng)脲濃度低于1.8mol/L時(shí)，腺苷酸激酶二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有尤其顯著改變，不過(guò)酶催化活力卻顯著提升，在脲濃度達(dá)到1mol/L時(shí)，提升了1.6 倍。而伴隨脲濃度增加，酶催化活力沒(méi)有繼續(xù)提升，反而開(kāi)始下降。 -278nm處光吸取改變；-222nm處CD光譜改變；-酶相對(duì)活性-ANS熒光標(biāo)識(shí)相對(duì)強(qiáng)度；- ANS熒光標(biāo)識(shí)慢相速度常數(shù)相對(duì)值 第62頁(yè)第62頁(yè)不同濃度下ANS與腺苷酸結(jié)

26、合慢相速率常數(shù) 第63頁(yè)第63頁(yè)4，有機(jī)溶劑和表面活性劑 在一些情況下，低濃度有機(jī)溶劑和表面活性劑能夠有助于底物溶解，同時(shí)也能夠使酶分子部分變性，從而提升酶分子催化活性。如在5%-10%乙醇-磷酸鹽緩沖溶液中，酪氨酸酶和漆酶催化活力能夠提升30-50%。 第64頁(yè)第64頁(yè)而甲醇、乙醇、丙醇和丁醇對(duì)青霉素V?；刚T導(dǎo)激活過(guò)程中，醇分子是以有機(jī)分子形式起作用。其激活機(jī)制如圖所表示。 第65頁(yè)第65頁(yè)第66頁(yè)第66頁(yè)表面活性劑如Tween 80處理Bacillus megaterium酯酶，可使酶催化對(duì)硝基苯酚己酯Km值減少，而Kcat/Km值提升14倍。非離子表面活性劑濃度在0.1%0.8%時(shí)，吐

27、溫80、聚乙二醇等作為纖維素酶激活劑，可使纖維素酶活力提升20%-50%。而陰離子表面活性劑濃度在0.1%0.8%時(shí)，如十二烷基磺酸鈉也可作為纖維素酶激活劑。第67頁(yè)第67頁(yè)5，小分子有機(jī)化合物 在有機(jī)胺類化合物（二乙胺、二異丙胺、三乙胺、吡啶等）存在下，磷酸三酯酶催化活性伴隨有機(jī)胺濃度改變而改變；當(dāng)有機(jī)胺濃度較低時(shí)，磷酸三酯酶催化活性明顯提升，顯示出有機(jī)胺化合物對(duì)磷酸三酯酶激活作用，但當(dāng)有機(jī)胺濃度增大時(shí)（0.1mol/L），則表現(xiàn)出較強(qiáng)克制作用。 第68頁(yè)第68頁(yè) 6，高分子化合物 高分子化合物如聚乙烯亞胺、聚精氨酸、聚賴氨酸等聚電解質(zhì)，在低濃度溶液中能夠與酶蛋白分子表面相反電荷互相作用，多

28、點(diǎn)靜電引力結(jié)合也許使酶活性中心附近空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而提升酶催化活力。如聚乙烯亞胺，聚丁基亞胺分別使乳酸脫氫酶活力提升3.0和 5.0倍。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)對(duì)煙草硝酸還原酶也含有較強(qiáng)激活作用。 第69頁(yè)第69頁(yè)二、激活作用動(dòng)力學(xué) 一些激活劑激活作用主要是由于激活劑與游離酶相結(jié)合形成活性酶復(fù)合物，激活劑與底物相結(jié)合形成復(fù)合活性底物；或者和E、ES都能結(jié)合形成三元復(fù)合物等各種情況。因激活作用和克制作用類同，在此僅就二種類型激活作用簡(jiǎn)述下列。 第70頁(yè)第70頁(yè)1，激活劑A與酶形成EA活性復(fù)合物 激活動(dòng)力學(xué)模型與克制動(dòng)力學(xué)模型采用一致符號(hào)，可表示下列: 第71頁(yè)第71頁(yè)以穩(wěn)態(tài)法處理可得到下列反

29、應(yīng)速度方程式: 第72頁(yè)第72頁(yè)顯而易見(jiàn)，這類型激活劑只影響反應(yīng)Km值，并不影響Vmax。若和克制劑類型相類比，應(yīng)屬于競(jìng)爭(zhēng)性活化。其倒數(shù)方程可表示下列： 第73頁(yè)第73頁(yè)A加大，斜率減少，反應(yīng)速度增大，A減少，斜率增大，反應(yīng)速度減少；A0, 0。另外，當(dāng)S= (在A存在前提下)時(shí), Vmax。若固定S，以1/1/A作圖可求出KA：第74頁(yè)第74頁(yè)對(duì)S1和S2不同底物濃度下所得到1/1/A兩直線相交于一點(diǎn)：1/A=-1/KA。假如激活劑A與底物結(jié)合，其模型可表示以下： 第75頁(yè)第75頁(yè)第76頁(yè)第76頁(yè)2，激活劑與游離酶、酶-底物復(fù)合物結(jié)合 第77頁(yè)第77頁(yè)激活劑和酶結(jié)合不影響底物與酶結(jié)合，同樣底

30、物結(jié)合也不影響激活劑與酶結(jié)合。激活劑作用只對(duì)酶活性有影響，也就是說(shuō)，末結(jié)合激活劑ES復(fù)合物是無(wú)活性，只有ESA三元復(fù)合物才有活性。以快速平衡法得到下列方程：第78頁(yè)第78頁(yè)顯然此種類型激活劑只影響Vmax而不影響及Km，屬于非競(jìng)爭(zhēng)性活化作用。其倒數(shù)方程下列： 第79頁(yè)第79頁(yè)直線斜率為（1+KA/A）Ks/Vmax，縱軸截距為（1+KA/A）/Vmax。橫軸截距為- 1/Ks(1/=0, 1/S= -1/Ks)。若已知激活劑A濃度和Vmax就能夠計(jì)算出KA。以Dixon作圖法也能夠得到KA。當(dāng)S為常數(shù)時(shí)，1/1/A作圖是直線，而且S1和S2不同底物濃度下所得到1/1/A兩直線相交于一點(diǎn)：1/A

31、=-1/KA。 第80頁(yè)第80頁(yè)第81頁(yè)第81頁(yè)第82頁(yè)第82頁(yè)第83頁(yè)第83頁(yè)第四節(jié)，酶對(duì)化學(xué)物質(zhì)催化作用酶作為一個(gè)高效生物催化劑，它含有比化學(xué)催化劑更優(yōu)越性能。利用生物催化劑實(shí)既有機(jī)化合物生物合成和生物轉(zhuǎn)化是一門以有機(jī)合成化學(xué)為主，與生物學(xué)密切聯(lián)系交叉學(xué)科，它也是當(dāng)今有機(jī)合成化學(xué)研究熱點(diǎn)和主要發(fā)展方向。酶不但能夠催化天然有機(jī)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化，也能在生物體外催化天然或人工合成有機(jī)化合物各種轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并且顯示出優(yōu)良化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。因此，酶催化反應(yīng)提供了許多常規(guī)化學(xué)辦法不能或不易合成化合物合成辦法，能合成和制備包括光學(xué)純醫(yī)藥、農(nóng)藥及中間體在內(nèi)復(fù)雜功效化合物，是一個(gè)有助于環(huán)境保護(hù)綠

32、色化學(xué)過(guò)程。 第84頁(yè)第84頁(yè)一、酶制劑類型 即使自然界中發(fā)覺(jué)酶已達(dá)3000各種，但由于酶生產(chǎn)成本等方面限制，工業(yè)上有價(jià)值酶只有不到100種，能大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用只有十各種，如淀粉酶，蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、脂酶等。在酶催化化學(xué)反應(yīng)中，由于反應(yīng)類型，反應(yīng)條件，反應(yīng)體系以及完畢底物轉(zhuǎn)化規(guī)模等原因，需要考慮所使用酶制劑類型。為了提升酶制劑穩(wěn)定性和催化效率，能夠?qū)γ钢苿┍旧磉M(jìn)行修飾和改性，因此，在酶催化化學(xué)反應(yīng)中，除了使用溶液狀態(tài)酶制劑以外，還可采用下列酶制劑類型。 第85頁(yè)第85頁(yè)酶制劑起源第86頁(yè)第86頁(yè)1，完整細(xì)胞 一些含有較高酶活力細(xì)胞（如微生物、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞）組織、

33、細(xì)胞器等，不通過(guò)度離直接用于催化反應(yīng)，或用物理或化學(xué)辦法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固定化催化劑利用。固定化細(xì)胞可省掉提取工藝，使酶損失達(dá)到最低程度。有時(shí)能夠利用細(xì)胞復(fù)合酶系統(tǒng)催化幾種相關(guān)反應(yīng)。固定化細(xì)胞辦法主要有兩種類型：即包埋法和共價(jià)交聯(lián)法。 第87頁(yè)第87頁(yè)2，固定化酶 酶固定化是通過(guò)物理或化學(xué)辦法，將酶束縛在某種載體上，使酶只能在一定空間內(nèi)進(jìn)行催化活動(dòng)，底物通過(guò)擴(kuò)散作用與酶接觸并發(fā)生反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物擴(kuò)散到反應(yīng)介質(zhì)中與酶分離。而酶則能夠重復(fù)進(jìn)行催化作用。這種酶在反應(yīng)體系中以固相形式存在，因此稱為固定化酶或固相酶。固定化酶不但保持了酶原有性質(zhì)，并且賦予了酶新特性。比如固定化酶含有一定

34、機(jī)械強(qiáng)度，能夠攪拌或裝柱，易于回收和重復(fù)使用，產(chǎn)物容易分離，容易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程連續(xù)化。另外，酶固定化后，能夠提升對(duì)溫度及酸堿穩(wěn)定性。 第88頁(yè)第88頁(yè)3，修飾酶 化學(xué)修飾目的是將酶分子表面親水基團(tuán)改變?yōu)槭杷鶊F(tuán)，使得酶能夠在有機(jī)介質(zhì)中有效分散，溶解在有機(jī)溶劑中，從而提升酶催化效率。典型例子是用單甲氧基聚乙二醇共價(jià)修飾脂肪酶、過(guò)氧化物酶等自由氨基，修飾酶能均勻溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中，同時(shí)表現(xiàn)出較高酶催化活性和穩(wěn)定性。 第89頁(yè)第89頁(yè)采用聚乙二醇共價(jià)修飾Candida rugosa脂肪酶，在異辛烷中催化酯合成反應(yīng)，酶催化活力比未修飾酶提升數(shù)十倍；另外聚丙烯醇修飾、聚丙烯酸甲酯修飾、脂肪酸修飾酶在

35、有機(jī)溶劑中也表現(xiàn)出較好催化活性。酶分子表面以及活性中心基團(tuán)也能夠與表面活性劑或脂肪酸互相作用，形成復(fù)合物。用非離子表面活性劑處理各種蛋白酶形成復(fù)合物在無(wú)水有機(jī)溶劑中催化二肽合成，酶催化活力可提升26倍。而采用硬脂酸處理脂肪酶和蛋白酶（對(duì)酶進(jìn)行非共價(jià)修飾），修飾酶在有機(jī)溶劑中酯互換活力提升了15倍，產(chǎn)物光學(xué)收率達(dá)到100%ee。 第90頁(yè)第90頁(yè)二、酶催化反應(yīng)介質(zhì) 水是酶促反應(yīng)最慣用反應(yīng)介質(zhì)。在水溶液中采用游離酶催化化學(xué)反應(yīng)不存在底物及產(chǎn)物擴(kuò)散問(wèn)題。由于底物、產(chǎn)物和酶都處于溶解狀態(tài)，底物容易進(jìn)入酶活性中心，產(chǎn)物也容易進(jìn)入緩沖體系中。但是，對(duì)于大多數(shù)有機(jī)化合物來(lái)說(shuō)，水并不是一個(gè)適宜溶劑，由于許多有

36、機(jī)化合物在水介質(zhì)中難溶或不溶。并且，由于水存在，往往有助于如水解、消旋化、聚合和分解等副反應(yīng)發(fā)生。 1，水介質(zhì)第91頁(yè)第91頁(yè)2，與水互溶有機(jī)溶劑水單相體系 有機(jī)溶劑與水形成均勻單相溶液體系。酶、底物和產(chǎn)物都能溶解在這種體系中。這類溶劑主要包括二甲基甲酰胺, 四氫呋喃, 二氧六環(huán), 丙酮，乙醇和甲醇等。該體系主要用于脂溶性底物轉(zhuǎn)化反應(yīng)。由于底物在水溶液中溶解度比較低, 因而反應(yīng)速度很低。在一些情況下，通過(guò)使用與水互溶溶劑能夠提升酯酶和蛋白酶催化反應(yīng)速度和選擇性。但這種極性有機(jī)溶劑經(jīng)常造成酶變性，催化活力減少。 第92頁(yè)第92頁(yè)3，非極性有機(jī)溶劑水兩相體系 由含有溶解酶水相和一個(gè)非極性有機(jī)溶劑(

37、高脂溶性)相所構(gòu)成兩相體系。這類有機(jī)溶劑主要是碳?xì)浠衔?、酯、含氯碳?xì)浠锏?。這種體系對(duì)于從有機(jī)相中有效地分離酶是非常有利。酶處于水溶液包圍環(huán)境中，不與有機(jī)溶劑直接接觸。大部分底物溶解在有機(jī)相中。在水相中，底物或產(chǎn)物有限濃度能夠避免對(duì)酶產(chǎn)生克制作用。產(chǎn)物從酶分子表面脫落進(jìn)入溶液中有助于反應(yīng)向生成產(chǎn)物方向進(jìn)行。 第93頁(yè)第93頁(yè)4，非極性有機(jī)溶劑酶懸浮體系 用非極性有機(jī)溶劑取代所有大量水，使固體酶懸浮在有機(jī)相中。即使從表面上看酶是干，但仍然含有必需結(jié)合水以保持酶催化活性(含水量普通小于2%)。懸浮體系中，酶狀態(tài)能夠是結(jié)晶態(tài)、凍干狀態(tài)、沉淀狀態(tài)，或者吸附在固體載體表面上。酶在有機(jī)介質(zhì)中良好分散狀態(tài)

38、是提升酶促反應(yīng)速度關(guān)鍵。 第94頁(yè)第94頁(yè)5，反向膠束體系 反向膠束是表面活性劑分子在非極性溶劑中自發(fā)形成熱力學(xué)穩(wěn)定、光學(xué)透明球形匯集體。從結(jié)構(gòu)上看，反向膠束有一個(gè)由表面活性劑分子烴鏈構(gòu)成外殼，疏水尾指向有機(jī)溶劑，極性頭指向匯集體內(nèi)部形成空腔,酶溶液被包在之中。由于反向膠束體系能夠較好地模擬酶天然環(huán)境，因而在反向膠束體系中，大多數(shù)酶能夠保持催化活性，甚至表現(xiàn)出超活性。比如酪氨酸酶、酸性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶在反向膠束中催化速度分別提升50、100、200倍。 第95頁(yè)第95頁(yè)6，超臨界流體 超臨界流體除含有老式有機(jī)溶劑所有長(zhǎng)處外，還含有液體高密度性、氣體高擴(kuò)散系數(shù)、低粘度和低表面張力，使底物向

39、酶?jìng)髻|(zhì)速度加快，從而使反應(yīng)速度提升。超臨界流體作為酶反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)酶促反應(yīng)起著主要作用, 它能夠改變酶底物專一性，位置（或區(qū)域）選擇性和對(duì)映體選擇性，并能增強(qiáng)酶穩(wěn)定性。慣用超臨界流體有CO2，SO2，CH2H4，C2H6，C3H8，C4H10等。其中以CO2最為常見(jiàn)，主要是由于它臨界條件溫和，利于酶保持生物活性。并且CO2價(jià)格廉價(jià)，無(wú)毒無(wú)污染，符合當(dāng)今綠色化學(xué)發(fā)展方向。 第96頁(yè)第96頁(yè)7，無(wú)溶劑體系無(wú)溶劑有機(jī)合成體系有下列幾種形式：（1）反應(yīng)物均為液體；（2）一個(gè)反應(yīng)物為固態(tài)，一個(gè)為液體；（3）兩種反應(yīng)物均為固體；（4）一個(gè)反應(yīng)物為氣體，另一個(gè)為固體。無(wú)溶劑有機(jī)合成反應(yīng)含有污染少、成本低、反應(yīng)

40、過(guò)程和處理過(guò)程簡(jiǎn)樸、產(chǎn)率高等特點(diǎn)當(dāng)前酶催化無(wú)溶劑有機(jī)合成反應(yīng)中，使用酶主要有脂肪酶、蛋白水解酶和糖苷酶。 無(wú)溶劑酶催化反應(yīng)主要包括下列幾種反應(yīng)體系：無(wú)溶劑體系（液態(tài)），固態(tài)-對(duì)-固態(tài)反應(yīng)體系（包括低共熔混合物反應(yīng)體系、超飽和底物反應(yīng)體系）以及干介質(zhì)反應(yīng)體系。 第97頁(yè)第97頁(yè)（1）液態(tài)無(wú)溶劑體系 酶催化底物為脂肪酸或脂肪酸酯（包括甘油酯）與脂肪醇（包括甘油），這些底物大多數(shù)在反應(yīng)溫度下呈現(xiàn)液體狀態(tài)，或者含有較低熔點(diǎn)，在稍稍高溫度下（50-70C）也呈液體狀態(tài)。這種反應(yīng)體系，除了加入保持酶催化活性所必須微量水之外，不再加入任何溶劑。采用這種反應(yīng)體系，能夠有效地合成在醫(yī)藥、食品、化妝品中使用油脂、

41、單甘油酯和各種脂肪酸酯等。 第98頁(yè)第98頁(yè)（2）“固-對(duì)-固”反應(yīng)體系在高底物濃度酶催化反應(yīng)中，反應(yīng)體系普通僅加10-30%水或有機(jī)溶劑，主要是固體反應(yīng)物。即起始反應(yīng)混合物主要由懸浮在少許溶劑中固體反應(yīng)物或高度飽和液體相構(gòu)成（水或有機(jī)溶劑），而最后反應(yīng)混合物主要由固體產(chǎn)物構(gòu)成，這種反應(yīng)體系被稱為“固體-對(duì)-固體”反應(yīng)。這種酶催化反應(yīng)主要用于酰胺、糖苷、糖酯合成。 第99頁(yè)第99頁(yè)多肽合成L-苯丙氨酸乙酯（油狀物）和L-亮氨酰胺（固體）混合物做底物，使用固定化枯草桿菌蛋白酶和糜蛋白酶作催化劑進(jìn)行肽合成。試驗(yàn)表明在這種無(wú)溶劑體系中，這兩種酶很容易催化反應(yīng)進(jìn)行，其中用枯草桿菌蛋白酶催化時(shí)可得到83

42、%產(chǎn)率（0.8g/每克固體反應(yīng)混合物）。 第100頁(yè)第100頁(yè)低共熔混合物介質(zhì) Kim J.等報(bào)道了用糜蛋白酶催化N-芐氧?；?L-天冬氨酸-乙酯與D-丙氨酸在9%DMSO，18%MEA和12%水構(gòu)成共熔反應(yīng)體系中合成一個(gè)甜味二肽衍生物，37C反應(yīng)6小時(shí)，反應(yīng)收率達(dá)到70%以上。 第101頁(yè)第101頁(yè)固體對(duì)固體反應(yīng)體系反應(yīng)體系普通僅加10-30%水或有機(jī)溶劑，主要是固體反應(yīng)物。即起始反應(yīng)混合物主要由懸浮在少許溶劑中固體反應(yīng)物或高度飽和液體相構(gòu)成（水或有機(jī)溶劑），而最后反應(yīng)混合物主要由固體產(chǎn)物構(gòu)成，這種反應(yīng)體系被稱為“固體-對(duì)-固體”反應(yīng)體系。 這種固體反應(yīng)物體系主要特點(diǎn)是反應(yīng)熱力學(xué)表現(xiàn)出類似“

43、開(kāi)關(guān)”行為，得到產(chǎn)率或者非常低，或者極其高 第102頁(yè)第102頁(yè)第103頁(yè)第103頁(yè)過(guò)飽和反應(yīng)體系在一些超飽和反應(yīng)體系中，水加入量高達(dá)40%以上。比如Isono,Y等在研究甜味二肽酶促合成中直接使用高濃度底物溶液（3.77mol/L）進(jìn)行反應(yīng)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率也可達(dá)到90%以上。Youshiko等用青霉素?；复呋?-氨基青霉烷酸（6-APA）與D-苯甘氨酸及D-苯甘氨酸甲酯酯化和酯互換反應(yīng)，使用過(guò)飽和底物水溶液，得到95-99.9%氨卞青霉素產(chǎn)物。 第104頁(yè)第104頁(yè)糖酯合成在脂肪酶催化脂肪酸糖酯合成中，Yan Y等在Candida Antarctica B脂肪酶催化硬脂酸葡萄糖酯合成中，使用2-

44、丁酮作為輔助劑，通過(guò)抽真空除去反應(yīng)中產(chǎn)生水，58小時(shí)反應(yīng)得到93%產(chǎn)率。同樣利用2-丁酮或丙酮作為輔助劑催化葡萄糖與各種脂肪酸（辛酸、棕櫚酸和硬脂酸）酯化或與各種脂肪酸甲酯酯互換反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上。第105頁(yè)第105頁(yè)（3）干介質(zhì)體系在干反應(yīng)技術(shù)中反應(yīng)物沉積在無(wú)機(jī)氧化物上，如氧化鋁、硅膠、高嶺土、硅藻土等均可用來(lái)作為反應(yīng)物載體，然后通過(guò)加熱辦法使反應(yīng)進(jìn)行。Novozyme Sp 435是由Novo(Denmark)公司將Candida antarctica脂肪酶固定化在聚丙烯酸樹(shù)脂上商品，能夠耐受80-100C高溫。而固定化在由硅膠制成Hyflo Supercell (HSC) 上Ps

45、eudomonas 脂肪酶也能夠耐受較高溫度。第106頁(yè)第106頁(yè) 將生物催化劑應(yīng)用于有機(jī)合成是當(dāng)前最吸引人研究領(lǐng)域。有機(jī)化合物生物合成和生物轉(zhuǎn)化是一門以有機(jī)合成化學(xué)為主，與生物學(xué)密切聯(lián)系交叉學(xué)科，它也是當(dāng)今有機(jī)合成化學(xué)研究熱點(diǎn)和主要發(fā)展方向。 酶不但在生物體內(nèi)能夠催化天然有機(jī)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化，也能在生物體外增進(jìn)天然或人工合成有機(jī)化合物各種轉(zhuǎn)化反應(yīng)，并且顯示出優(yōu)良化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性。第107頁(yè)第107頁(yè)三、酶催化有機(jī)化學(xué)反應(yīng)酶對(duì)所催化底物分子表現(xiàn)出不同選擇性。對(duì)于大多數(shù)酶來(lái)說(shuō)，選擇性是相正確。這類酶一個(gè)主要特性是能夠催化一些非天然底物，表現(xiàn)出廣泛底物適應(yīng)性。這是酶能夠應(yīng)用于有機(jī)反應(yīng)

46、研究和有機(jī)合成基礎(chǔ)。生物催化劑用于手性合成、對(duì)映體拆分中，不但能夠催化各種化學(xué)反應(yīng)，還能夠合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、含有生物活性大分子和高分子化合物。同時(shí)，能夠避開(kāi)化學(xué)法進(jìn)行手性合成與拆分時(shí)所需手性試劑，以及產(chǎn)生無(wú)效對(duì)映體和環(huán)境保護(hù)問(wèn)題。為此，用生物催化方法進(jìn)行化學(xué)合成又稱為“綠色合成”。 第108頁(yè)第108頁(yè)酶催化產(chǎn)物光學(xué)純度用對(duì)映體過(guò)量值(ee)表示，或用對(duì)映體比率E值表示。 式中ees表示底物對(duì)映體過(guò)量，eep表示產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量，其值通常在反應(yīng)開(kāi)始階段(轉(zhuǎn)化率20%)時(shí)測(cè)定。E值越大，表示酶選擇性越好；E值為1，表明酶對(duì)底物無(wú)選擇性?；?第109頁(yè)第109頁(yè)酶催化反應(yīng)類型酯酶、脂肪酶酯水解和合成酰胺

47、酶（蛋白酶、?；福０匪夂秃铣擅摎涿溉┩趸€原氧化酶（單加氧酶,雙加氧酶）氧化反應(yīng)過(guò)氧化物酶氧化、過(guò)氧化和鹵代反應(yīng)激酶磷酸化反應(yīng)（需ATP）醛縮酶、轉(zhuǎn)酮糖酶縮醛反應(yīng)（C-C鍵反應(yīng)）糖苷酶、糖基轉(zhuǎn)移酶糖苷鍵水解和形成磷酸化酶磷酸酯形成轉(zhuǎn)磺酸基酶硫酸酯形成轉(zhuǎn)氨酶氨基酸合成異構(gòu)酶、裂解酶、水合酶異構(gòu)化、加成、消除和取代反應(yīng)其它水解酶（環(huán)氧化物酶等）水解反應(yīng)第110頁(yè)第110頁(yè)1，水解反應(yīng) 水解酶催化各類反應(yīng)普通不需要特殊輔助因子，通過(guò)水解酶催化酯、環(huán)氧化物、酰胺等水解反應(yīng)，能夠得到各種光學(xué)活性醇、酸、酯或胺。 第111頁(yè)第111頁(yè)（1）環(huán)氧化物水解 環(huán)氧化物水解酶能催化環(huán)氧化物進(jìn)行不對(duì)稱水解，

48、比如手性吡啶型環(huán)氧乙烷是制備一些手性藥物關(guān)鍵中間體，黑曲霉(Aspergillus niger) 環(huán)氧化物水解酶催化吡啶型環(huán)氧乙烷水解反應(yīng)可得到手性環(huán)氧化物，對(duì)映體過(guò)量98%。 第112頁(yè)第112頁(yè)（2）腈類化合物水解 腈類化合物經(jīng)酶法水解轉(zhuǎn)化成相應(yīng)羧酸及其衍生物，是一個(gè)非常有用合成辦法，催化腈水解酶系有兩種類型：一個(gè)是腈水解酶，它催化腈直接水解，一步生成羧酸及NH3；另一個(gè)是腈水合酶，它催化腈水解生成酰胺，酰胺在酰胺酶作用下，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成羧酸及NH3，反應(yīng)過(guò)程需兩步完畢。 第113頁(yè)第113頁(yè)含有腈水合酶或腈水解酶酶活性微生物酶能夠催化轉(zhuǎn)化腈，用于生產(chǎn)專用或日用化學(xué)品、農(nóng)用化學(xué)品及藥物中間體

49、。腈水合酶能將腈催化轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酰胺類化合物，如用丙烯腈生產(chǎn)丙烯酰胺，用3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺。而腈水解酶能催化腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)羧酸和氨，如用3-氰基苯甲酸甲酯合成3-羧基苯甲酸甲。第114頁(yè)第114頁(yè)（3）酰胺水解 酰胺類化合物酶催化水解反應(yīng)廣泛應(yīng)用與氨基酸拆分和青霉素、頭孢霉素母核生產(chǎn)中，所使用酶主要是?；割悺６恍┑鞍酌?、脂肪酶及酰胺酶也能夠催化酰胺類化合物水解。 第115頁(yè)第115頁(yè)青霉素是人們經(jīng)常使用一個(gè)抗生素。但是，多年使用使得不少病原菌對(duì)青霉素產(chǎn)生了抗藥性。利用青霉素酰化酶，將青霉素母核（6-氨基青霉烷酸，6-APA）和側(cè)鏈水解，然后，利用化學(xué)合成辦法，使青霉素母核與其它側(cè)鏈連接起來(lái)

50、，從而研制出氨芐青霉素等新型青霉素。 第116頁(yè)第116頁(yè)頭孢菌素類抗生素是一類抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、療效高、毒性低抗生素。7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)半合成頭孢菌素主要中間體，國(guó)內(nèi)外在工業(yè)上多采用化學(xué)法由頭孢菌素C脫去其側(cè)鏈來(lái)生產(chǎn)7-ACA。 第117頁(yè)第117頁(yè)利用氨基?；父咝Ｒ恍运庖阴?L-氨基酸，將混旋乙酰-D/L-氨基酸選擇性水解得到L-氨基酸產(chǎn)品。未反應(yīng)乙酰-D-氨基酸再通過(guò)消旋化處理可重復(fù)使用。如蛋氨酸、苯丙氨酸等拆分，能夠得到99%eeL-構(gòu)型產(chǎn)物。 第118頁(yè)第118頁(yè)一些脂肪酶也能夠催化酰胺類化合物選擇性水解，得到光學(xué)活性產(chǎn)物，如A.melleus脂肪

51、酶催化N-(2-氟丙酰)-苯丙氨酸水解，得到(S,R)構(gòu)型產(chǎn)物。 第119頁(yè)第119頁(yè)（4）酯水解 除了酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)能夠催化酯水解以外，許多蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶, 枯草桿菌蛋白酶, 胰蛋白酶, 胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等）不但能選擇性地催化酰胺鍵水解，也能選擇性地水解氨基酸酯鍵。 第120頁(yè)第120頁(yè)應(yīng)用酶法水解拆分酯手性異構(gòu)體，普通產(chǎn)物光學(xué)純度為50-90%之間。為了提升產(chǎn)物光學(xué)純度, 能夠采用酶修飾、底物修飾或選擇適當(dāng)反應(yīng)溶劑等辦法改進(jìn)酶催化反應(yīng)選擇性。 -芳基或芳氧基羧酸酯用羧酸酯酶催化水解，可得到高光學(xué)純產(chǎn)物。如： 第121頁(yè)第121頁(yè)蛋白水解酶能選擇

52、性水解由L-構(gòu)型氨基酸形成酯，而對(duì)D-構(gòu)型氨基酸所形成酯不起催化作用。利用這種性質(zhì)，能夠?qū)⑾被狨ミM(jìn)行酶法拆分。 第122頁(yè)第122頁(yè)2，酯合成反應(yīng) 脂肪酶在水溶液中可催化油脂和其它酯類水解反應(yīng)，而在有機(jī)介質(zhì)中它催化水解反應(yīng)逆反應(yīng)酯合成反應(yīng)及酯互換反應(yīng)。 脂肪酶催化酯合成反應(yīng)底物專一性取決于酶類型，不同微生物起源脂肪酶催化不同鏈長(zhǎng)脂肪酸與不同鏈長(zhǎng)脂肪醇酯化反應(yīng)。比如脂肪酶MSL 在幾乎無(wú)水庚烷中催化油酸與正丁醇酯化反應(yīng)，產(chǎn)率可達(dá)到92。固定在硅膠上脂肪酶CCL催化合成正丁酸乙酯和正辛酸乙酯可達(dá)到100轉(zhuǎn)化率。 第123頁(yè)第123頁(yè)(1)位置選擇性酯化反應(yīng) 除了簡(jiǎn)樸烷基二醇、氨基醇和甾族二

53、醇外，脂肪酶也能催化碳水化合物位置選擇性?；磻?yīng)。如豬胰脂肪酶在吡啶中，采用高活性脂肪酸(C2C12) 三氯乙醇酯作為?；瘎┐呋咸烟堑葐翁遣；磻?yīng)，得到高度專一性6-O-脂酰化葡萄糖。 第124頁(yè)第124頁(yè)手性1,3-丙二醇衍生物是許多生物活性物質(zhì)合成原料。以2-取代-1,3-丙二醇和脂肪酸為原料，在有機(jī)溶劑介質(zhì)中用脂肪酶(CCL)或豬肝酯酶（PLE）催化酯化反應(yīng)，可得到較高光學(xué)純度R-或S-酯。 第125頁(yè)第125頁(yè)（2）手性化合物酶法拆分 手性羥基酯即使可通過(guò)酶催化水解拆分得到，但副反應(yīng)較多，產(chǎn)率較低。假如拆分在有機(jī)介質(zhì)中用脂肪酶(PSL)催化酯化進(jìn)行拆分，能夠避免副反應(yīng)發(fā)生。這個(gè)辦法

54、已經(jīng)成功地用于-羥基-,-不飽和酯拆分。 第126頁(yè)第126頁(yè) (3) 內(nèi)酯合成反應(yīng) 在一定條件下，-羥基酸或它酯在酶催化下，發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化作用得到內(nèi)酯化合物。內(nèi)酯可繼續(xù)反應(yīng)形成開(kāi)鏈寡聚物。小于四元環(huán)或不小于7元環(huán)內(nèi)酯是不穩(wěn)定, 因此主要形成線性聚合產(chǎn)物。五元環(huán)內(nèi)酯最容易形成。六元環(huán)內(nèi)酯形成經(jīng)常伴隨有部分直鏈寡聚物形成。 第127頁(yè)第127頁(yè)3，酰胺鍵形成反應(yīng) 在有機(jī)介質(zhì)中，許多酰胺水解酶類能夠催化酰胺鍵形成反應(yīng)，如蛋白酶類、脂肪酶類以及?；割悾ㄇ嗝顾仵；傅龋?第128頁(yè)第128頁(yè)（1）酰胺合成反應(yīng) 酯酶催化氨解反應(yīng)能夠生成酰胺，這個(gè)反應(yīng)含有良好立體選擇性，是合成手性酰胺一個(gè)有價(jià)值辦法。

55、比如枯草桿菌蛋白酶催化正丁酸三氟乙基酯-甲基芐胺氨解，形成手性酰胺化合物。 第129頁(yè)第129頁(yè)由于脂肪酶含有同蛋白水解酶相同催化機(jī)制，因此它也能夠催化胺類化合物?；磻?yīng)和酯胺解反應(yīng)。 第130頁(yè)第130頁(yè)利用青霉素?；复呋嗝顾厮夥磻?yīng)逆反應(yīng)，人們采用超飽和體系或加入產(chǎn)物復(fù)合試劑等辦法，合成了氨芐青霉素等抗生素，產(chǎn)率達(dá)80%以上。 第131頁(yè)第131頁(yè)（2）肽合成 有機(jī)溶劑中酶催化多肽合成，主要是利用蛋白酶催化多肽水解逆反應(yīng),肽轉(zhuǎn)移反應(yīng)或氨解（氨基酸酯氨解）反應(yīng)進(jìn)行。 第132頁(yè)第132頁(yè)4，氧化還原反應(yīng) 催化氧化還原反應(yīng)酶類包括脫氫酶和氧化酶。這些酶能夠催化羰基還原、醇氧化、烯烴環(huán)氧化以

56、及芳香烴羥化反應(yīng)。 第133頁(yè)第133頁(yè)（1）脫氫酶類 如醇脫氫酶能夠催化羥基氧化和羰基還原可逆反應(yīng)，利用脫氫酶來(lái)還原羰基能夠得到光學(xué)純度極高手性醇類化合物，反應(yīng)需要輔酶NAD(P)H參與。然而，NAD(P)+和NAD(P)H價(jià)格通常比酶促反應(yīng)所得產(chǎn)物要貴得多，因此，有必要對(duì)輔酶進(jìn)行再生并循環(huán)使用。當(dāng)前用于NAD(P)+和NAD(P)H再生發(fā)展得比較完善辦法是酶法再生。 第134頁(yè)第134頁(yè)酶法再生通常由合成體系和再生體系兩部分構(gòu)成，合成體系用來(lái)制備目的產(chǎn)物，再生體系則用于輔酶再生。再生中用得最多酶是脫氫酶，另一方面有氧化酶、氫化酶等。在該辦法中，應(yīng)用甲酸/ 甲酸脫氫酶（FDH）再生體系技術(shù)經(jīng)濟(jì)性最好。當(dāng)前，甲酸/ FDH再生NADH已被用于工業(yè)生產(chǎn)L-叔亮氨酸、光學(xué)活性醇等合成。 第135頁(yè)第135頁(yè)在有機(jī)介質(zhì)中，將輔酶與酶一起吸附在載體表面水穴中，載體上輔因子能自由地進(jìn)入和退出酶活性部位而不會(huì)從載體上脫落到介質(zhì)中，從而增長(zhǎng)了輔因子穩(wěn)定性，提升了它循環(huán)效率。當(dāng)前有機(jī)介質(zhì)中酶催化氧化還原反應(yīng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于光學(xué)活性醛、酮和醇制備。許多脫氫酶，如酵母脫氫酶YADH和馬肝醇脫氫酶HLADH等能將前手性酮還原為手性仲醇，它們催化酮還原反應(yīng)立體選擇性遵循Prelog規(guī)則，如HLADH還原2-三環(huán)癸酮消旋體，產(chǎn)生手性醇。 第136頁(yè)第136頁(yè)酵母中含有各種還原酶，能催化芳香