楊璐-化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體(西北大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè))2011.6課件

1、化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測梅毒螺旋體抗體答辯人： 楊璐 導(dǎo) 師： 崔亞麗 教授 李如琳 副教授 西北大學(xué) Contents1. 背景介紹3. 全文總結(jié)2. 實(shí)驗(yàn)部分梅毒 梅毒螺旋體 嚴(yán)重性傳播疾病 發(fā)病率不斷上升 2010年4月國家衛(wèi)生部全國法定 傳染病疫情報(bào)告： 全國乙類法定傳染病發(fā)病第位梅毒檢測：孕前檢查 供血者血液常規(guī)篩選檢查西北大學(xué) 醫(yī)院常用梅毒螺旋體免疫學(xué)檢測方法快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)（RPR）和甲苯胺紅試驗(yàn)(TRUST) 初篩 假陽性高 判斷主觀梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）和梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA） 確認(rèn) 判斷主觀 操作繁瑣 要求嚴(yán)格梅毒ELISA實(shí)驗(yàn) 靈敏

2、度有待進(jìn)一步提高 西北大學(xué) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)免疫分析系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（抗原、抗體，免疫反應(yīng)）免疫分析高特異性及化學(xué)發(fā)光高靈敏度于一體（酶的化學(xué)發(fā)光底物或氧化劑）西北大學(xué) 梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光法檢測 靈敏度極高 自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光法檢測梅毒的商品化試劑盒國外： Abbott：ARCHITECT Syphilis TP 磁粒 國內(nèi)： 北京科美東雅生物技術(shù)有限公司：梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光試劑盒 酶標(biāo)板西北大學(xué) 聚乙烯酶標(biāo)板板表面包被面積有限反應(yīng)空間有限靈敏度受限化學(xué)發(fā)光固相載體的選擇磁性微粒比表面積大分散性好易分離靈敏度更高西北大學(xué) 包被反應(yīng)檢測實(shí)驗(yàn)原理西北大學(xué) 第一部分 方法的優(yōu)化1HRP標(biāo)

3、記抗原稀釋液的確定2包被抗原最佳用量及酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定3樣本稀釋液的確定4保護(hù)劑的選擇西北大學(xué) HRP標(biāo)記抗原稀釋液的確定a PBST+20%小牛血清b PBST+0.1%BSAc PBST+0.5%BSAd PBST+1%BSAe PBST+1.5%BSA降低非特異性吸附 ： 加入非特異性蛋白與表面活性劑陰性樣本的發(fā)光值西北大學(xué) 樣本稀釋液的確定陽性血清稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果1PBS生理鹽水PBS+0.1%BSA 正常人血清1:25+1:50+1:100+1:200+1:400+1:800+1:1600+1:3200+1:6400+ -+ -+1:12800-+1:25600-+ -+

4、-1:51200-最佳樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA檢測靈敏度與正常人血清相當(dāng)西北大學(xué) 保護(hù)劑的選擇保護(hù)劑X對HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用良好HRP標(biāo)記抗原置于37、放置6天西北大學(xué) 保護(hù)劑Proclin300與保護(hù)劑X的對比實(shí)驗(yàn)選定濃度為0.05%的Proclin300作為保護(hù)劑西北大學(xué) 保護(hù)劑Proclin300對HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用含0.05%Proclin300的 HRP標(biāo)記抗原置于37、放置6天西北大學(xué) 第一部分實(shí)驗(yàn)小結(jié) 在初步建立的化學(xué)發(fā)光檢測梅毒螺旋體抗體方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，確定各最佳工作條件如下：1. HRP標(biāo)記抗原稀釋液：PBST+1% BSA作為HRP 標(biāo)記抗原稀釋

5、液；2. 抗原包被量：210 ng/孔(7 g/mg )；3. 酶標(biāo)抗原稀釋濃度：1: 3000時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最佳；4. 血清樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA；5. 保護(hù)劑：濃度為0.05%Proclin300的PBS緩沖液。西北大學(xué) 4參考值6對比實(shí)驗(yàn)1穩(wěn)定性3標(biāo)準(zhǔn)曲線25精密度特異性第二部分 實(shí)驗(yàn)方法的評價(jià)西北大學(xué) 穩(wěn)定性化學(xué)發(fā)光試劑分別置于4冰箱和37生化培養(yǎng)箱中放置6天將陽性血清分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍后進(jìn)行檢測西北大學(xué) 精密度國家標(biāo)準(zhǔn)（15%） 批內(nèi)差： 2.86%5%次數(shù)檢測結(jié)果陽性檢測平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715

6、574715594923586052P N59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大學(xué) 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品10次重復(fù)測定結(jié)果質(zhì)控品：抗-TP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2NCU/mL）相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：5.42%西北大學(xué) 標(biāo)準(zhǔn)曲線將梅毒螺旋體抗體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（4 NCU/mL）梯度稀釋，在0.25

7、 4 NCU/mL范圍內(nèi)線性良好Y = 599.1X-165.9R2 = 0.9980西北大學(xué) 特異性陰性符合率均為100% 80例臨床血清樣本 20例乙肝陽性血清 樣本（TP陰性） 20例丙肝陽性血清 樣本（TP陰性）本次實(shí)驗(yàn)：COV=N2.1=54.6發(fā)光值西北大學(xué) 乙肝陽性樣本檢測結(jié)果丙肝陽性樣本檢測結(jié)果COV=54.6COV=54.6發(fā)光值發(fā)光值乙肝血清樣本丙肝血清樣本陰性符合率均為100%西北大學(xué) 化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法與商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒對比靈敏度比商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍陽性血清稀釋倍數(shù)檢測結(jié)果商品化試劑盒化學(xué)發(fā)光磁酶免法(MECLIA)1:100+1:200+1:400+

8、1:800+1:1600+1:3200+1:6400-+1:12800-+1:25600-+ -1:51200-西北大學(xué) 化學(xué)發(fā)光磁酶免法（COV=N2.1=53.2）商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒COV=N2.1=26151）特異性對比實(shí)驗(yàn)：二者相當(dāng)，陰性符合率均100%發(fā)光值發(fā)光值20例陰性血清樣本20陰性血清樣本COV=53.2COV=26151西北大學(xué) 西北大學(xué) 第二部分實(shí)驗(yàn)小結(jié)國家法規(guī)：體外診斷試劑注冊管理辦法分析性能評估資料：分析靈敏度、分析特異性、檢測范圍 批內(nèi)不精密度、批間不精密度等項(xiàng)目參考值（參考范圍）確定穩(wěn)定性研究資料發(fā)光免疫分析試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則 根據(jù)各個(gè)試劑盒的企業(yè)標(biāo)

9、準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密性（批內(nèi)差）、相關(guān)性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。穩(wěn)定性：4，及37加速破壞性實(shí)驗(yàn)，均顯示保存穩(wěn)定性良好；精密度： 批內(nèi)差在2.865%，批間差在5.19.7%，對質(zhì)控品重復(fù) 10 次檢測，變異系數(shù)為5.42%，均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（ 15%）方法評價(jià)結(jié)果西北大學(xué) 標(biāo)準(zhǔn)曲線：在0.25 4 NCU/mL范圍內(nèi)線性范圍良好臨界值：臨界值為陰性對照血清均值的2.1倍特異性：檢測臨床TP抗體陰性血清，陰性符合率為100%，特異性良好對比實(shí)驗(yàn)：靈敏度較商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍，特異性二者相當(dāng)西北大學(xué) 穩(wěn)定性 精密度線性范圍 參考值特異性

10、對比實(shí)驗(yàn)HRP標(biāo)記抗原稀釋液抗原包被量酶標(biāo)抗原稀釋濃度血清樣本稀釋液保護(hù)劑對方法進(jìn)行比較全面的評價(jià)方法的進(jìn)一步優(yōu)化初步建立的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法全文總結(jié)：西北大學(xué) 試劑盒研制成功中試放大梅毒抗體臨床科研血清盤梅毒螺旋體抗體診斷試劑國家參考品臨床試驗(yàn)西北大學(xué) 主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究資料 半成品試劑盒的檢定成品試劑盒的檢定 Company Logo 包被抗原酶標(biāo)抗原試劑盒陽性對照品、陰性對照品研制Company Logo主要原材料研究資料穩(wěn)定性研究資料批間穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性檢測試劑盒成品穩(wěn)定性檢測試劑盒開封穩(wěn)定性Company Logo性能評估資料試劑靈敏度的考察試劑特異性的考察試劑重復(fù)性的考察試劑準(zhǔn)確性的考察 與市售同類產(chǎn)品的比較Compan