血清白球蛋白的分離、純化及鑒定試驗用課件

1、 血清白蛋白、-球蛋白的分離、純化及鑒定目的要求(一)掌握分離純化蛋白質(zhì)的基本原理。(二)了解柱層析技術(shù)。（一）分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病?；蚬こ痰男枰ǘ┓蛛x純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)

2、用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個階段： 材料的選擇和預(yù)處理 破碎細胞及提取（有時還需要進行細胞器的分離） 分離純化：包括粗分級分離和細分級分離其中前兩個階段為生物大分子分離純化的前處理。選擇材料破碎細胞提取分離純化分析及鑒定 一、鹽析（中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離。鹽析

3、法的優(yōu)點： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡單、安全。 對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。鹽析的基本原理蛋白質(zhì)水溶膠的穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。 破壞水化膜，暴露出疏水區(qū)域， 中和電荷，破壞親水溶膠+等點電時的蛋白質(zhì)（親水膠體）帶負電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）脫水脫水脫水帶負電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）不穩(wěn)定蛋白顆粒陰離子陽離子堿酸酸蛋白質(zhì)聚集沉淀帶正電荷蛋白質(zhì)（親水膠體）堿+水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）中性鹽的選擇常用的中性鹽：(NH4)2SO4 1) 溶解度大： 0 20 80 100 （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4

4、4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 硫酸銨在0時的溶解度，遠遠高于其它鹽類2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一 步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有 的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的（NH4）2SO4保存可達數(shù)年之久。4) 價格便宜，廢液不污染環(huán)境。色 譜 法chromatography脫鹽和純化石油醚（流動相M）植物葉子的石油醚萃取液(樣本)碳酸鈣（固定相S）玻璃管（色譜柱）胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A、B連續(xù)色帶（色譜）1906年俄國植物學(xué)家米哈伊爾.茨維特二特點1、高

5、效能2、高度選擇性3、高靈敏度4、操作簡單不足之處：定量精確，但定性較差 色譜三、色譜的種類氣相色譜液相色譜氣液色譜氣固色譜液液色譜液固色譜1、吸附色譜法2、分配色譜法3、離子交換色譜法4、凝膠色譜法5、親和色譜法按原理分類二、脫鹽（凝膠層析法）透析只用于除鹽類和小分子雜質(zhì)超過濾除小分子雜質(zhì)，分離、濃縮蛋白質(zhì)加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液凝膠層析又叫分子篩層析。 具備條件：1惰性，2水不溶性，3能高度水化。常用分子篩： 葡聚糖凝膠（Sephadex） 型號：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15 分離大蛋白質(zhì)、小蛋白質(zhì)，除鹽 瓊脂糖凝膠（瑞典Sepha

6、rose、美國Bio-GelA） 孔徑大，用于分離大分子物質(zhì) 聚丙烯酰胺凝膠（ Bio-GelP） 離子交換色譜（ion exchange chromatography） 以離子交換劑為固定相，利用樣品中不同的生物大分子的帶電部分與具有相反電荷的離子交換劑吸附強弱不同，而將混合物中的不同離子進行分離的色譜技術(shù)。 三、純化（離子交換色譜法）陽離子交換劑（cation exchanger）兩種離子交換劑陰離子交換劑（anion exchanger）RSO3H+ + Na+RS O3 Na+ + H+RNH4 OH+ClRNH4+ Cl+OH離子交換劑的化學(xué)成分 1、樹脂類：分離氨基酸，孔徑?。?2

7、、纖維素類：分離蛋白質(zhì)，孔徑大。通過改變鹽濃度，輔助改變pH值進行梯度洗脫。陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨乙基纖維素陽離子交換層析過程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強度洗脫液洗高離子強度洗脫液洗加樣平衡液洗收集球蛋白中： 及球蛋白的pI6.5，帶負電 而球蛋白的pI6.5(pI7.3) ，帶正電 球蛋白先洗脫出來。白蛋白中： 、及白蛋白均帶負電，掛于柱上 先用低鹽洗去、球蛋白 再用高鹽競爭洗下白蛋白DEAE纖維素陰離子交換層析:本次實驗純化采用操 作一、鹽析 白蛋白、球蛋白的粗分離 取0.5ml血清 取

8、0.5ml飽和(NH)SO溶液， 緩慢滴入，邊加邊搖。 混勻后于室溫中放置10分鐘。 8000r/min10min 小心吸取上清液，作為純化白蛋白用。 沉淀加0.5ml蒸餾水，使之溶解，作為純化 球蛋白用。洗脫液中蛋白質(zhì)及鹽分的檢查取96孔板一塊，上四排加300g/L三氯乙酸溶液 ，下三排加BaCl2液。從下端管口取1滴洗脫液，滴于300g/L三氯乙酸中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有蛋白質(zhì)析出。從下端管口取1滴洗脫液，滴于BaCl2中，出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。二、G-25凝膠層析脫鹽（一）葡聚糖凝膠G-25層析柱的制備（二）上樣與洗脫：1、小心控制凝膠柱下端活塞，使柱上緩沖液面剛好

9、下降到凝膠床表面(注意不要使液面低于凝膠床表面以致空氣進行凝膠床)。2、關(guān)緊下端出口，用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢的加到凝膠床表面上(注意不要將凝膠粒中沖起或破壞凝膠床表面的平整)。3、開下端出口，使樣品進入凝膠床（剛好下降到凝膠床表面），關(guān)閉出口，小心加入適量pH6.5的0.02mol/L NH4Ac緩沖液。4、放開，流速約20滴/分鐘，立即收集并檢測， 20磺基水楊酸檢測到蛋白后收集三管，10滴/管。 顏色最深而且無渾濁的管用于下一步操作。5、 BaCl2檢測出現(xiàn)白色混濁或沉淀即有鹽分析出，不再收集。6、平衡再生：繼續(xù)洗脫30ml。7、白蛋白樣品脫鹽。 15滴/管收集三、純化（陰離子交

10、換層析）將脫鹽后含球蛋白的溶液加于DEAE纖維陰離子交換柱上，用0.02mol/L NH4Ac緩沖液洗脫，分管收集洗脫液。檢測到蛋白后立即收集三管，10滴/管，編號。（純化的-球蛋白）繼續(xù)洗脫30ml將脫鹽后含白蛋白的溶液加于柱上，用0.06mol/L NH4Ac洗脫30ml。改用0.3mol/L NH4Ac洗脫，檢測到蛋白后立即收集三管，15滴/管，編號。（純化的白蛋白）再生： 1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH4Ac 20ml， 0.02mol/L NH4Ac 40ml。四、醋酸纖維素薄膜電泳檢查（1）血清（2）粗分的-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）純化的-球蛋白液（5）純化的白蛋白液樣品： 以醋酸纖維薄膜為支持物，在pH=8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白的PI均小于8.6，帶負電荷，電泳時向正極移動，由于遷移率不同而被分離。實驗原理 1準備與點樣2. 電泳（點樣面朝下，110V 1h）3氨基黑10B染色5分鐘4. 漂洗2cm粗糙面操作步驟學(xué)號（1）血清（2）粗分的-球蛋白液（3）粗分的白蛋白液（4）純化的-球蛋白液：由于此溶液濃度較低，應(yīng)多次點