微波輔助低共熔溶劑提取、部分純化螺旋藻多糖及其體外生物學活性研究

1、微波輔助低共熔溶劑提取、部分純化螺旋藻多糖及其體外生物學活性研究螺旋藻(Spriulinaplatensis)營養(yǎng)價值較高，是商業(yè)上必不可少的微藻之一，可直接用作食物或食物成分，亦可用作生物肥料、廢水處理和生物柴油生產，以及化妝品和制藥行業(yè)1-2，其含有大量的蛋白質、必需脂肪酸(亞油酸和-亞麻酸)、多糖、氨基酸、維生素，尤其是復合維生素B和色素等3。螺旋藻中分離的多糖具有廣泛的生物活性，如抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒和免疫應答等4。目前，可以借助熱水、稀堿和不同的有機溶劑提取和分離多糖5-6，然而，這些傳統(tǒng)的提取方法通常復雜、耗時、低效且對環(huán)境有害。低共熔溶劑(deep eutectic sol

2、vent，DES)作為新一代環(huán)境友好的“綠色”溶劑，具有替代有機溶劑的潛力，已引起廣泛關注7。一般來說，DES是由氫鍵受體和氫鍵供體混合而成的8。氯化膽堿價格低廉、可生物降解且無毒，是最常用的氫鍵受體，而氫鍵供體可以是糖、醇或羧酸。DES已被證明是一種新型綠色溶劑，具有無毒、可生物降解和不可燃等優(yōu)異的性能9-10。目前，DES正被用于有機合成和(生物)催化、生物化學、分析化學、納米材料和提取過程11-15。高效、無污染的DES輔助微波提取法已廣泛用于從天然植物材料中提取生物活性化合物，如類黃酮、異黃酮、酚類化合物和天然色素等16-19。然而，關于利用DES從螺旋藻中提取多糖的研究鮮有報道。本研

3、究評價了不同組合的DES對螺旋藻多糖提取效果的影響。在確定最佳的DES溶劑基礎上，利用響應面優(yōu)化法對與多糖得率相關的主要提取條件參數(shù)進行了優(yōu)化，并通過大孔樹脂對其部分純化，對其抗氧化和抗癌活性進行評價。1 材料和方法1.1 材料、試劑和設備螺旋藻粉末由甘肅省微藻技術創(chuàng)新中心提供；氯化膽堿、DL-蘋果酸、檸檬酸、甘油、乙二醇、1, 4-丁二醇、尿素、L-脯氨酸、丙二醇、甲醇、乙醇、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素、MTT，北京索萊寶科技有限公司；大孔樹脂D3520，天津允開樹脂科技有限公司；DP

4、PH(純度99.5%)、ABTS(純度98.0%)，上海源葉生物科技有限公司；丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT，純度98%)、維生素C (純度98%)，成都德斯特生物科技有限公司；人宮頸癌細胞的HeLa細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司。所有其他試劑和化學品均為分析純。U-T6 紫外可見分光光度計，屹譜儀器制造(上海)有限公司；DF-101S5L數(shù)顯恒溫水油浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MCR-3微波化學反應器，鞏義市科瑞儀器有限公司。1.2 DES合成DES的合成是將氫鍵受體氯化膽堿和1種或者2種氫鍵供體按照一定物質的量比混合，80 磁力攪拌34

5、h，直至形成清澈均勻的液體，制備得到DES。結果如表1所示。表1 不同類型DES的制備Table 1 Preparation DES systems in the experiment1.3 微波輔助低共熔溶劑提取多糖為了選擇最佳提取溶劑，在微波反應管中稱取1 000 mg螺旋藻粉末加入10 mL DES水溶液(去離子水含量:30%，質量分數(shù))，采用微波反應系統(tǒng)在80 下處理30 min，混合物以8 000g離心15 min。在定量分析之前，用相應提取溶劑將上清液固定到20 mL。實驗重復3次。采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，其得率由以下公式(1)計算:多糖得率(1)式中：C，提取液中的多糖質量

6、濃度，mg/mL；V，稀釋提取物的體積，mL；m，提取樣品的質量，g1.4 微波輔助DESs提取多糖的優(yōu)化在微波輔助DES提取多糖的過程中，DES含水量、提取時間、提取溫度和固(樣粉)-液(提取劑)比是4個主要因素。通過改變水含量(0%、10%、20%、30%、40%、50%，質量分數(shù))、提取時間(10、20、30、40、50、60 min)、提取溫度(50、60、70、80、90、100 )和固液比(10、20、30、60、80、100 mg/mL)，研究微波輔助DES提取螺旋藻多糖條件?；谝陨蠈嶒灲Y果，采用響應面法優(yōu)化其提取工藝。應用BBD獲得該提取中4個主要自變量的最佳值：DES含水量

7、(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)和固液比(D)在3個不同水平(-1、0、1)。以多糖得率作為設計實驗的響應值?；趯嶒灁?shù)據(jù)進行回歸分析。隨后，在最佳條件下進行了3次驗證提取實驗，以驗證統(tǒng)計實驗策略的準確性。1.5 從DES提取物中回收和部分純化多糖在最佳條件下提取后，將DES提取多糖裝載到大孔樹脂D3520-Cl(3.5 cm30 cm)上。用100 mL去離子水洗滌以除去DES后，用100 mL 0.1 mol/L(洗脫液1)、0.3 mol/L(洗脫液2)和0.5 mol/L(洗脫液3)的NaCl溶液以3 mL/min的流速梯度洗脫該柱；然后，分別收集洗脫液并采用苯酚-硫酸法測定洗脫

8、液中多糖含量，選擇目標組分用于進一步的體外活性檢測。1.6 多糖的抗氧化活性1.6.1 DPPH自由基清除活性將提取和部分分離的多糖溶解在蒸餾水中以獲得不同質量濃度(0.1、0.5、1、2、3、4和5 mg/mL)的樣品溶液。然后，將0.1 mL多糖溶液與0.4 mL DPPH乙醇溶液(0.1 mol/L)混合后在室溫遮光條件靜置，反應30 min后，在517 nm處測定吸光度。用DES提取的多糖清除DPPH自由基活性與已知的抗氧化劑(如BHT和維生素C)進行了比較。DPPH自由基清除活性按照公式(2)計算:DPPH自由基清除活性(2)式中：A空白，空白對照(含有除多糖之外的所有試劑)的吸光度

9、；A樣品，樣品的吸光度。1.6.2 ABTS陽離子自由基清除活性將97.15 mg ABTS和16.13 mg過硫酸鉀與蒸餾水混合制備ABTS陽離子自由基儲備溶液(25 mL)。室溫下黑暗中孵育12 h，然后用無水乙醇稀釋至734 nm處的吸光度為(0.700.02)。將0.1 mL不同質量濃度(0.1、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL)的樣品加入到0.9 mL ABTS溶液中，并在黑暗中孵育20 min。在734 nm處測量吸光度。維生素C和BHT作為陽性對照。ABTS陽離子清除活性按公式(3)計算:ABTS陽離子清除活性(3)式中：A空白，空白對照的吸光度(包含除多糖之外的所有試劑)

10、；A樣品，樣品的吸光度1.7 多糖抗癌活性1.7.1 細胞系和培養(yǎng)物HeLa細胞在含有10%(體積分數(shù))熱滅活FBS和100 g/mL青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 和5% CO2的中培養(yǎng)。1.7.2 生長抑制試驗為了評估DESs提取多糖對HeLa細胞生長的抑制作用，將細胞接種(5104)在96孔板中，其中含有100 L熱滅活培養(yǎng)基，并在5% CO2培養(yǎng)箱中于37 孵育24 h。然后，將含有來自DES提取物的0、50、100、200、300、400 g/mL多糖的新鮮培養(yǎng)基加入到96孔板中，并在相同的條件下分別孵育24、48、72 h后，向每個孔中加入5 mg/mL MTT

11、溶液(10 L)，細胞在37 和5% CO2下孵育4 h。除去培養(yǎng)基后，向每個孔中加入150 L DMSO。反應后，在490 nm處測量樣品的吸光度。抑制率按公式(4)計算:抑制率(4)式中：A空白和A樣品分別為對照和試驗樣品的吸光度1.8 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用平均值標準誤差表示，差異之間顯著性通過方差分析(ANOVA)進行檢驗，P0.05為差異顯著，P0.01為差異極顯著。2 結果與分析2.1 微波輔助DES提取多糖的工藝優(yōu)化2.1.1 不同類型DESs對多糖提取效果的影響為了評估最佳DES提取溶劑，本研究評估了9種不同類型的DES對多糖提取效果的影響(圖1)。圖1 不同種類低共熔溶劑對螺旋藻多糖

12、提取效果的影響Fig.1 Effects of different DESs on the yield of polysaccharide fromSpirulinaplatensis分別以不同醇、有機酸和尿素與氯化膽堿的固定混合物質的量比合成了3種醇基DES(DES-1、DES-2和DES-4)、3種有機酸基DES(DES-5、DES-6和DES-7)和1種脲基DES (DES-3)。DES-8和DES-9為3種組分的混合物。與常規(guī)溶劑相比，由于范德華力、氫鍵和不同組分間的靜電相互作用，DESs具有較高的黏度。為提高提取效率，以質量比73加水，用9種不同的DESs溶劑從螺旋藻中提取多糖，其中

13、醇基DESs提取效果最好，其次是有機酸基 DESs和脲基DESs。與2種組分的混合物相比，DES-8和DES-9對多糖的提取能力不同，但均低于醇基DES。醇基DESs具有相對較小黏性和表面張力,1, 4-丁二醇內部空間足夠大且醇基分支少, 且羥基的存在，增加了其與多糖的相互作用，其極性更適合多糖提?。淮送?，醇基DESs的提取效率高于水?；谏鲜鼋Y果，選擇由氯化膽堿和1, 4-丁二醇(物質的量比為14)組成的DES-4作為提取多糖的溶劑，并應用于后續(xù)試驗。2.1.2 DES含水量的影響合成的DES具有一定的黏度，會影響萃取效率，具有一定含水量的DES體系有利于傳質。由圖2-a可知，在DES中加入

14、不同含量的水提取螺旋藻多糖時，提取效果依賴于DES含水量。當DES體系中的含水量從0%增加到30%時，螺旋藻多糖得率顯著增加。然而，含水量的進一步增加(30%50%)導致提取效果降低，這可能是因為DES系統(tǒng)中高濃度的水可能會限制多糖和DES組分之間的相互作用。因此，DES含水量選擇30%用于進一步的實驗。2.1.3 提取時間、提取溫度和固液比的影響為了研究提取時間、提取溫度和固液比對螺旋藻多糖提取率的影響，樣品在這些因素變化的條件下依次提取，而保持其他提取條件不變。如圖2所示，提取效率受提取時間、溫度和固液比的影響?；谶@些結果，Box-Behnken設計選擇了以下最佳DES提取條件：提取時間

15、30 min、提取溫度80 和固液比為20 mg/mL。2.1.4 采用Box-Behnken設計優(yōu)化提取條件在單因素試驗的基礎上初步確定提取變量的范圍后，使用Box-Behnken設計優(yōu)化提取條件，響應面分析的因素和水平見表2。a-DES含水量；b-提取時間；c-提取溫度；d-固液比圖2 DES含水量、提取時間、提取溫度和固液比對多糖提取效果的影響Fig.2 Effects of different extraction parameters on the yield of polysaccharides.DES water content, extraction time, extract

16、ion temperature, and solid-liquid ratio表2 響應面分析中的因素和水平Table 2 Factors and levels in the response surface analysis整個研究包括29個獨立的實驗，每個處理重復3次。與該實驗相關的編碼變量和響應如表3所示。表3 BBD實驗設計結果Table 3 Results of the BBD for extraction optimization預測模型的截距、線性、二次和交互作用項的回歸系數(shù)見表4。模型P0.000 1，表明該預測模型具有統(tǒng)計學意義，A、B、AC、BC、A2、B2、C2、D2參數(shù)

17、具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；說明實驗因子與方程之間不是簡單線性關系；DES水含量(A)和提取時間(B)是多糖提取工藝的主要決定參數(shù)。響應變量的決定系數(shù)(R2)為0.96，這意味著該回歸模型可以預測結果。表4 響應面方差分析結果Table 4 The results the response surface analysis of variance失擬項P值為0.098 1，差異不顯著 (P0.05)，說明預測模型可準確地反映實驗數(shù)據(jù)。基于對所有實驗數(shù)據(jù)的多元回歸分析，使用二階多項式方程來表示預測模型?；貧w模型方程如下：Y=108.05-1.57A-1.77B+0.027C-0.26D+1.8

18、4AB-3.26AC-1.51AD-2.15BC+0.96BD+0.76CD-9.98A2-4.77B2-5.50C2-6.48D2式中：Y，多糖得率；A，DES含水量；B，提取時間；C，提取溫度；D，固液比。通過對二階多項式方程的分析，得出最佳提取條件為：DES含水量28.89%；提取時間27.74 min；提取溫度80.78 ，固液比19.81 mg/mL，獲得的多糖得率為108.34 mg/g。在實驗過程中，考慮到實驗實際操作條件，對以上數(shù)據(jù)進行修正：DES含水量29%、提取時間28 min、提取溫度81 、固液比20 mg/mL，在此條件下，獲得的多糖平均得率為109.80 mg/g，

19、說明此法可用于多糖的提取。2.1.5 微波輔助DES提取與其他提取方法的比較為了評價微波輔助DES提取法在提高提取效率方面的優(yōu)勢，將微波輔助DES提取法與包括熱堿浸提5、超聲波輔助提取20、回流提取6、三相萃取21和內部沸騰法22在內的其他螺旋藻多糖提取方法進行了比較，結果本法采用微波輔助提取具有最高的多糖得率。由于DES-4溶劑黏性和表面張力小, 1, 4-丁二醇內部空間足夠大且醇基分支少, 氫鍵和多糖相互作用強，且極性更適合多糖提??；另外，微波的輻射作用穿透螺旋藻細胞，使得細胞壁破裂，有利于多糖的溶出。因此，本實驗采用的微波輔助DES提取方法有效地提高了多糖的產量。2.2 多糖的回收和部分

20、純化根據(jù)最佳提取條件制備螺旋藻多糖，并按照1.5的方法對粗多糖提取物進行純化。分別對3種洗脫組分(洗脫液1、洗脫液2和洗脫液3)進行收集、減壓濃縮和透析、干燥處理。洗脫液1、洗脫液2和洗脫液3中多糖質量分別為(4.570.22)、(86.590.17)和(3.960.24) mg；多糖含量分別為(19.581.24)%、(88.960.47)%和(84.101.21)%。洗脫液2含有最高的多糖，其多糖含量相對高于洗脫液1和洗脫液3。因此，選擇并大量產生洗脫液2，用于體外進一步的活性檢測。2.3 多糖的抗氧化活性2.3.1 DPPH自由基清除活性從螺旋藻中提取的多糖的抗氧化活性如圖3所示。DPP

21、H經(jīng)常被用作檢測化合物的自由基清除活性的代表性試劑。如圖3-a所示，樣品顯示出濃度依賴性的DPPH自由基清除活性。與對照相比，活性水平依次增加順序為：提取物、BHT和維生素C。當樣品質量濃度從0.1 mg/mL增加到5 mg/mL時，提取物的DPPH自由基清除活性從19.58%增加到89.1%。提取多糖的IC50值(能夠清除50% DPPH的提取物濃度)為0.97 mg/mL?；谶@些結果，可以初步推斷，在最佳條件下使用DES從螺旋藻中提取的多糖顯示出優(yōu)異的DPPH 自由基清除活性，因此其可以作為主要抗氧化劑。a-DPPH自由基；b-ABTS陽離子自由基圖3 螺旋藻多糖DPPH自由基和ABTS

22、陽離子 自由基清除活性Fig.3 DPPH radical and ABTS cation radical-scavenging activities of the polysaccharides extracted fromS.platensis2.3.2 ABTS陽離子自由基清除活性與DPPH自由基清除活性類似，樣品的ABTS陽離子自由基清除活性在較高濃度下逐漸增強，與對照組相比，清除活性依次增加順序為：提取物、BHT和維生素C(圖3-b)。以上結果證實了用DES體系提取的螺旋藻多糖具有顯著的體外ABTS陽離子自由基清除活性，IC50值為0.91 mg/ mL。DES被認為適合用于從螺旋藻中微波輔助提取多糖的溶劑體系，因此，所