高效液相色譜方法的建立

1、高效液相色譜方法的建立高效液相色譜法的應(yīng)用遠遠廣于氣相色譜法。它廣泛用于合成化學(xué)、石油化學(xué)、生命科學(xué)、臨床化學(xué)、藥物研究、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗及法學(xué)檢驗等領(lǐng)域。它應(yīng)用如此廣泛，那么問題來了，我們在選擇液相色譜法時該如何建立方法?如何建立一個HPLC的方法?能夠開發(fā)一個新方法對于HPLC的初學(xué)者來說有很大吸引力，旦是新手往往會感覺無法下手，其實完全不是那么一回事，只要你有一臺雙泵或者四元泵的HPLC,看了本文，就可以上手去做了。首先我們要保證的一個根本原則是：我們要做出來的是一個有穩(wěn)定，明顯的分離，并且在檢測器的響應(yīng)明顯，有定量理論基礎(chǔ)的方法。這句話中的“穩(wěn)定”、“明顯”是必要條件，有一點不達標(biāo)方

2、法就沒意義。然后，對于新手來說，最好遵守這樣一個小原則：我們從不新建，我們只是套用高效液相色譜方法的建立樣詁制備分關(guān)模式的遙擇色譜柱的選釋*流動相的選擇洗脫方式的優(yōu)化檢測方式的選擇HPLC方法曹立的步驟收集樣品信息*明確分析的目的和要求選擇樣品制備方憩確定檢測方法和條件確定HPLC分祈檢式，選擇相應(yīng)色譜粒*優(yōu)化分離離件-定性.定址分析方法驗證樣品信息樣品中的化學(xué)成分，及各或分的含盤范圍化合物的結(jié)構(gòu)或官能團化舎物的分子量化臺物的酸就性和pK養(yǎng)pith值適宜的樣品溶劑及溶解度化合物的紫外服收光譜分析目的和要求*準(zhǔn)確度，分離度靈敏度主慮分的定性、定量分析速度-雜質(zhì)分析”如有關(guān)物質(zhì)及陳解產(chǎn)物尊藥物代謝

3、勒力學(xué)或藥物代謝物研究中藥有效成分或捋標(biāo)成分的定性.定盤中藥措紋圖鍛分析*合成聚含胸或生物大分子的分子量我獲井布或序列分析嗎實崟日的.嗎實崟日的.tl樣分折舸.膛輛耍駐尊選擇適豈的樣品處現(xiàn)方法霜解、稀執(zhí)過濾趣聲萃戰(zhàn)帶剖萃収*鬧棚萃取*多種方式聯(lián)臺使用-柱前衍生，柚后衍生注帝匚供試品洛割與色譜條件的匹配HPLC模式的選擇HPLC模式的選擇HPhC分離模式及應(yīng)用范圍HPhC分離模式及應(yīng)用范圍哲講柱盤用范出矗傅MNJLCIS.cs.tft.M備請F朮育凱觀音幣敢的申畝沖蚌痕iPaWM-Fl圮售坊盤耳干烷呑整flQinLC莆帕VUgtiHi捕IO1Ur=瓊林本欄于卓書侶育増我的比吿柏N(W立井，也*$

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5、f廿才古建耳trttsmn口!V牧減陸豐少ttviRumH*Ktrim耳MKRtVX.flWzfttt.TTFB-ftJB甬：九廈站用嵐!1PK1-c流動相的選擇反相色譜有機洛制：甲SL紳.四組映睛畀丙醇導(dǎo)戡：瞬嚴(yán),乙熟甲酸.三藝酸尊僚:三邑臨稀瓠水違載色請柱的號受性零克呻對試?Rh嫌基碩栽鈉丸訊化四丁基整聲緩沖鹽；碑脫鹽，醋酸鹽榆母帔鹽零檢測方法的選擇折光檢寞審科憑笈光敵射檢諾罄t週用：糕環(huán)娥乏UWfi應(yīng)】嶂面豹白一牝測宦秦知成分的含豎t靈數(shù)度相對較養(yǎng)蔬光檢測憎：選擇性.較禹興敏度B!/nMH；對溫度.爲(wèi)劑性圖pHft-電化學(xué)梯溝Sh選萍性校禺靈龜度;；對流連溫度需于強亂PH欝堆骼；錐護絞麻

6、煩、質(zhì)諾檢為器】選捽性靈敦度謹(jǐn)用性*化。佝分于量矗站枸何恵：柑對較貴ift渤相獨越赭裁隹處的吸枚血應(yīng)紫外檢測ift渤相獨越赭裁隹處的吸枚血應(yīng)霰至菠長一、在食品分析中的應(yīng)用1.食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機胺、礦物質(zhì)等;2.食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等;食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、微量元素、多環(huán)芳烴等。二、在環(huán)境分析中的應(yīng)用環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥（如氨基甲酸脂類，反相色譜）殘留等三、在生命科學(xué)中的

7、應(yīng)用HPLC技術(shù)目前已成為生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家在分子水平上研究生命科學(xué)、遺傳工程、臨床化學(xué)、分子生物學(xué)等必不可少的工具。其在生化領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中于兩個方面：1.低分子量物質(zhì)，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。2.高分子量物質(zhì)，如多肽、核糖核酸、蛋白質(zhì)和酶（各種胰島素、激素、細胞色素、干擾素等）的純化、分離和測定。過去對這些生物大分子的分離主要依賴于等速電泳、經(jīng)典離子交換色譜等技術(shù)，但都有一定的局限性，遠遠不能滿足生物化學(xué)研究的需要。因為在生化領(lǐng)域中經(jīng)常要求從復(fù)雜的混合物基質(zhì)，如培養(yǎng)基、發(fā)酵液、體液、組織中對感性趣的物質(zhì)進行有效而又特異的分離，通常要求檢測限達ng級或pg級，或pmol，fmol，并要求重復(fù)性好、快速、自動檢測;制備分離、回收率高且不失活。在這些方面，HPLC具有明顯的優(yōu)勢。體液中代謝物測定;藥代動力學(xué)研究;臨床藥物監(jiān)測：