DB1301-T136-2009用卵黃檢測禽新城疫免疫抗體技術(shù)規(guī)程

1、DB1301石家莊市地方標(biāo)準(zhǔn)DB1301/T1362009用卵黃檢測禽新城疫免疫抗體技術(shù)規(guī)程2009-07-10 實施2009-07-10 2009-07-10 實施石家莊市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB1301/T136DB1301/T136200911本標(biāo)準(zhǔn)由石家莊市畜牧水產(chǎn)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位:新樂市畜牧水產(chǎn)局本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：任二華、甄輝欣、侯全中、李榮達、馬麗榮DB1301/T136DB1301/T136200922用卵黃檢測禽新城疫免疫抗體技術(shù)規(guī)程1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蛋禽新城疫免疫抗體卵黃檢測技術(shù)中的樣本釆集、試驗準(zhǔn)備、試驗方法、結(jié)果判定 等操作方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于用卵黃進行蛋禽新城疫活疫苗

2、、滅活疫苗免疫抗體檢測。本標(biāo)準(zhǔn)適用于種禽場入孵種蛋新城疫母源抗體水平的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的 修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達成協(xié)議的各方研究 是否可以使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB165501996新城疫檢疫技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1蛋禽已經(jīng)產(chǎn)蛋的禽類。3.2檢樣經(jīng)過直接稀釋卵黃待檢液或氯仿萃取制備好的、用于檢測的上清液。3. 3跳管血凝抑制試驗中，同一檢樣在反應(yīng)板上出現(xiàn)的前、后孔凝集抑制而中

3、間孔凝集的現(xiàn)象。4樣本采集采集蛋禽免疫接種新城疫活疫苗14d后或滅活疫苗21 d后所產(chǎn)的新鮮禽蛋。5試驗準(zhǔn)備5.1材料準(zhǔn)備5.1.1儀器設(shè)備96孔90V型微量反應(yīng)板、微量移液器、滴頭、離心管、微量振蕩器、離心機、液體快速混合器、 容量瓶等。5.1.2試劑5.1.2.1檸檬酸鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、蒸饞水等。5.1.2.2新城疫濃縮抗原、新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。5. 2試液配制5. 2.1 pH7.07.2磷酸緩沖鹽水（PBS液）配制：（亦可用生理鹽水代替）稱取氣化鈉170 g,磷酸二氫鉀13.6 g,氫氧化鈉3.0g,用適量蒸餡水溶解后，移入1000 ml容 量瓶中，定溶。用0.0

4、1mol/L氫氧化鈉或O.Olmol/L鹽酸調(diào)pH值至7. 0-7.2,高壓滅菌后4C保存 備用，使用時作20倍稀釋。5. 2.2 1% （V/V）雞紅細(xì)胞懸液配制DB1301/T136DB1301/T136200911釆集至少三只未免疫新城疫疫苗的健康公雞的血液與等體積抗凝劑（3.8%檸様擾鈉溶液）混合， 用20倍量PBS液洗滌34次，每次均以2 000 r/min離心34 min,最后一次離心10 min,洗滌后 用PBS配成1% （V/V）紅細(xì)胞懸液，或先配成10%濃懸液（可在4C下保存35d）用時作10倍稀釋。 5.3檢樣制備5. 3.1卵黃直接稀釋在樣品管中加入0.5 mlPBS,再

5、吸取0.5 ml卵黃做1:1稀釋，混勻制成卵黃檢樣備用。5. 3.2卵黃氯仿萃取取5.3.1制備好的卵黃檢樣0.4 ml加入等量氯仿，迅速用液體快速混合器充分振蕩混勻，室溫靜 置30 min, 3 000 r/min離心5 min,取上清液備用。6試驗方法6,1抗原血凝效價測定（HA試驗，微量法）操作方法按GB16550執(zhí)行。6.2血凝抑制（HI）試驗（微童法）6.2.1卵黃直接稀釋測定法操作方法按GB16550執(zhí)行。用5. 3.1中制備的卵黃檢樣代替被檢血清進行檢測。檢測時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽 性血清對照。6.2.2卵黃氯仿萃取測定法2.T適用范圍在卵黃直接稀釋測定法檢測出現(xiàn)“跳管”或測不出抗體時，釆用

6、卵黃氯仿萃取法檢測。方法操作方法按GB16550執(zhí)行。用5.3.2中制備的檢樣代替被檢血清進行檢測。檢測時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陽性血 清對照。1結(jié)果判定7.1試驗結(jié)果成立條件只有陽性血清對照出現(xiàn)正確結(jié)果的情況下，試驗結(jié)果才有效。HI滴度的計算方法以完全抑制4個HAU抗原的樣本最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。樣本制備過程中卵黃的稀釋倍數(shù)和 加入氯仿量都計入該樣本的稀釋倍數(shù)。7.3判定方法7. 3.1卵黃直接稀釋測定法結(jié)果判定將“檢樣制備”過程中樣本的稀釋倍數(shù)計入終點滴度判定，即：微量反應(yīng)板上血凝抑制的終點滴度 加一個滴度為該樣本的HI抗體效價（終點滴度為零時則不再加）。舉例：微量反應(yīng)板上血凝抑制的終 點滴度是2七則該樣本HI抗體效價為2、7.3.2卵黃氯仿萃取測定法結(jié)果判定將“檢樣制備”過程中樣本的稀釋倍數(shù)計入終點滴度判定，即：微量反應(yīng)板上血凝抑制的終點滴度 加兩個滴度為該樣本的HI抗體效價（終點滴度為零時則不再加）。舉例：微量反應(yīng)板上血凝抑制的