海洋芽孢桿菌的發(fā)酵

1、摘要從海洋微生物代謝產(chǎn)物中可篩選出多種具有特殊功能的天然抗菌與抗病毒活性 物質(zhì)。本課題組從東海海泥中篩選出一株產(chǎn)溶菌酶的菌株S-12-86。本論文對該菌所 產(chǎn)溶菌酶的發(fā)酵條件、純化方法及其生物活性進(jìn)行研究，結(jié)果如下： 采用搖瓶發(fā)酵的方式，分別從培養(yǎng)基組分與發(fā)酵條件兩個方面對海洋芽抱桿菌 S-12-86產(chǎn)酶的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：菌株S-12-86能夠利用麥芽糖、淀粉、甘 油和葡萄糖作為碳源，不能利用蔗糖與甘露醇；能夠利用牛肉膏、酵母膏、蛋白豚和 硫酸銨作為氮源，其中牛肉膏效果最佳，而硝酸鉀、氯化銨和尿素幾乎不被利用；Zn2+、 Mn2+和Cu2+對菌株S-12-86的生長和產(chǎn)酶均有抑制作用，

2、Fe2+對菌體生長無明顯影響，但 明顯抑制菌體產(chǎn)酶，Na+和K+對菌體的生長和產(chǎn)酶無明顯影響，Ca2+對菌體生長有促進(jìn)作 用，Mg2+對菌體生長和產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用。該菌種產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基組分為葡 萄糖 10.0 g/L，蛋白豚 5.0 g/L，MgSO45.0 g/L，CaCl22.0 g/L。菌株 S-12-86 最適發(fā) 酵條件：培養(yǎng)溫度為30C、接種量為4.0%(v/v)、裝液量為10.0%(v/v)、產(chǎn)酶高峰在 發(fā)酵24 h。經(jīng)測定，產(chǎn)酶量達(dá)25636.8 U/mL，比優(yōu)化前14454.4 U/mL提高了 75.4%。中試發(fā)酵產(chǎn)酶量達(dá)26697.87 U/mL，說明搖瓶發(fā)酵優(yōu)化條件可以應(yīng)

3、用于中試生產(chǎn)上。 與白色鏈霉菌G、灰色鏈霉菌P-51、枯草芽抱桿菌77等產(chǎn)溶菌酶微生物的產(chǎn)酶條件 相比較，菌株S-12-86具有易培養(yǎng)、產(chǎn)酶量較高、生產(chǎn)成本較低等優(yōu)點(diǎn)。將海洋芽抱桿菌 S-12-86 溶菌酶(marine Bacillus S-12-86 lysozyme， MBL)的發(fā) 酵液經(jīng)過硫酸銨分級沉淀與透析脫鹽，Sephadex G-100凝膠柱層析，CM Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析分步進(jìn)行純化。將純化得到的MBL以Tricine-SDS進(jìn)行分析，分子量為16.0 kD。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果表明，MBL最適作用pH值為8.0，最適作用 溫度為35Co Zn2+和

4、Cu2+對MBL具有一定的激活作用，Mn2+和Ag+對 MBL略有抑制作用，其它金屬離子如Ba2+、Li+、Ca2+、Na+、K+和Fe3+等對 MBL活性沒有顯著影響；化學(xué)試劑與增稠劑對MBL活性幾乎沒有影響。陽離子烷基多苷(cationicAlkylpoly glycosides，cAPG)和烷基多苷(Alkyl poly glycosides，APG)對 MBL 有激活作用，分別提高M(jìn)BL的活性為15%和21%；十二烷基磺酸鈉(Sodium dodecyl sulfate， SDS)對其有抑制作用，降低酶活性約為15%； Tween 20，Tween 80對MBL的影響不 明顯。MBL在

5、低溫下保存，酶活性較常溫保存損失?。籑BL的凍干粉在常溫保存與 低溫保存酶活損失相差不大，說明酶凍干粉比液體酶更適合于保存。MBL的抑菌譜較為廣泛，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌等標(biāo)準(zhǔn)菌株均 有抑制作用，主要抑制上述菌對數(shù)生長期初期的生長。電鏡觀察結(jié)果表明，經(jīng)MBL 作用12 h后，大腸埃希氏菌有些菌體細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)不均勻，開始固縮，導(dǎo)致質(zhì)壁分離， 部分細(xì)胞壁缺失，細(xì)胞膜破裂，菌體變形，有些細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)甚至解體出現(xiàn)空腔。金黃 色葡萄球菌細(xì)胞質(zhì)不均勻，固縮較嚴(yán)重，中間有顏色較深成團(tuán)物質(zhì)出現(xiàn)，細(xì)胞壁變薄， 有些細(xì)胞壁模糊不清，還存在質(zhì)壁分離現(xiàn)象。白色念珠球菌大部分菌的細(xì)胞壁出現(xiàn)嚴(yán) 重變形，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)

6、不均勻，細(xì)胞質(zhì)中的空腔更多。酶對白色念珠球菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的 破壞作用隨著時間的延長而增強(qiáng)。MBL發(fā)揮抑菌作用的濃度范圍在0.25 mg/mL4.0 mg/mL之間，發(fā)揮殺菌作用的濃度范圍一般在0.25 mg/mL8.00mg/mL之間。MBL含量在大于5.0 mg/mL時，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌 有明顯的抑菌作用。0.5%1.5%的APG無明顯抑菌作用。將MBL與APG復(fù)配后， APG能明顯地增強(qiáng)酶的抑菌作用。通過定量殺滅細(xì)菌試驗，測定5.0 mg/mLMBL+1.0 mg/mL APG 復(fù)配后(Compound Enzyme Prepration，簡稱 CEP)的殺菌率；結(jié)果

7、表明， CEP對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠球菌均有較強(qiáng)的殺菌能力。CEP在54C 培養(yǎng)箱中放置14 d后，其殺菌率保持不變，說明CEP的殺菌性能的穩(wěn)定性良好。米用細(xì)胞病變抑制實驗(Cytopathogenic inhibition test)觀察MBL在PK15細(xì)胞中對偽狂犬病病毒的抑制作用，研究MBL對偽狂犬病毒的抗病毒作用。結(jié)果表明，MBL 的半數(shù)中毒濃度(TC50)為100.0M g/mL；抑制偽狂犬病病毒的半數(shù)有效濃度(EC50) 為0.46p g/mL、治療指數(shù)(TI)為217；在病毒感染后的0 h、2 h、4 h、6 h和8 h, MBL均有抑制偽狂犬病病毒的作用。結(jié)論，M

8、BL在PK-15細(xì)胞中對偽狂犬病病毒具 有較好的抑制作用。此外，MBL對新城疫病毒也有較好的體內(nèi)抑制作用。關(guān)鍵詞：海洋芽抱桿菌S-12-86 ；抗菌；抗病毒；溶菌酶Studies on fermentation,purification and biology activityof marine Bacillus S-12-86 lysozymeAbstractMany antibacterial and antiviral substances possessed special function could be obtained from marine microorganism.Our

9、 research group had gotten marine Bacillus S-12-86 from the sea mud sample collected from the East Sea of China which produced lysozyme.Based on the research,the project studies mainly focused on fermentation, purification and biology activity of marine Bacillus S-12-86 lysozyme(MBL).The results sho

10、wed as:The culture medium and fermentation conditions of marine Bacillus S-12-86 were studied.Marine Bacillus S-12-86 could utilize maltose,starch,glycerol and glucose as carbon sources but not mannitol or sucrose;it also could utilize beef extract,yeast extract, tryptone and ammonium sulfate as nit

11、rogen sources,not potassium nitrate,ammonium chloride,or urea.Beef extract was the best the carbon source.Zn2+,Mn2+and Cu2+inhibited the growth or enzyme production of the strain.Fe2+had no effect on the growthof the strain,but inhibited the enzyme production.Na+and K+had no effect on the growthor e

12、nzymeproduction.Ca2+had little effect on the enzyme production but promoted thegrowth of thestrain obviously.Mg2+had good effect on both the strain growth and enzymeproduction.The optimum fermentation conditions for marine Bacillus S-12-86 wereincubation of 24 h,incubation temperature a t 30 degrees

13、 Celsius,inoculums level 4%(v/v), medium volume 10%(v/v)and initial pH value 8.0.The results showed that the optimum culture media components were glucose 10.0 g/L，tryptone 5.0g/L，MgSO4 5.0 g/L，CaCl2 2.0 g/L.Comparison of MBL production before optimization(14454.4 U/mL)with that after optimization(2

14、5636.8 U/mL),MBL in optimized process increased by about 75.4%.The pilot production experiment indicated that the enzyme production was 26697.87 U/mL. The results indicated that the fermentation conditions selected from flask could be applied to the pilot production.Comparison of the culture conditi

15、ons of marine Bac illus S-12-86with those of Streptomyces albus G,Streptomyces griseus P-51,Bacillus subtilis77,et al, we could find that marine Bacillus S-12-86 was easily cultured with greater enzyme production and lower production cost.We could concluded that marine Bacillus S-12-86 had the poten

16、tial to be used at large scale in practice.A novel bacteriolytic enzyme was purified from the crude culture of MBL by ammonium sulfate precipitation,Sephadex G-100 chromatography and CM-Sephadex A-50 ion-exchange chromatography.The molecular weight was 16.0 kD.The optimal pH and temperature for the

17、Micrococcus lysodeikticus was 8.0 and 35 C， respectively.Zn2+ and Cu2+could stimulate the activity,whereas Mn2 + or Ag+inhibited the lytic activity.Ba2+Li+Ca2+，Na+， K+and Fehad no effect on the enzyme activity.MBL was stablein some chemicals and thickening agents.Containing 0.1g/L surfactant,the rel

18、ative enzyme activity was improved for 15%or 21%by Alkyl poly glycosides(APG)or cationic Alkyl poly glycosides(cAPG)respectively,decreased 15%by Sodium dodecyl sulfate(SDS),and had no change in Tween 20 or Tween 80 solution.The activity of liquid enzyme had more loss at room temperature than that at

19、 low temperature,lyophilized powder of the enzyme at room temperature or low temperature had significant differences at the enzyme activity.Three results showed that lyophilized powder was fitter to be saved than that in liquid for MBL.MBL had a broad antimicrobial spectrum against standard strains

20、including G+,G- and fungi,et al.MBL influenced bacteria on the logarithmic growth prophase.Observation under the transmission electron microscope revealed that the cytoplasm of E.coli was concentrated,cell membrane was separated from cell and part of cell wall was disappeared, then the cell was brok

21、en down into cavity by MBL for 12 h.While the cytoplasm of S.aureaus was asymmetrical and serious contracted with fuscous conglobation,and the cell wall became thinner,cell membrane was separated from cell wall and part of cell wall was dim.The cell wall of Candida albicans was distortional seriousl

22、y,and the cytoplasm was asymmetrical.There were many cavities in the cytoplasm.The breakage effect of MBL on the inner structure of Candida albicans became stronger as the time running.Thebacteria inhibition concentration was between 0.25 mg/mL4.00 mg/mL and the bactericidal concentration was betwee

23、n 0.25 mg/mL8.00 mg/mL.We studied the anti-microbial activity of MBL and its Combinations with APGThe method was used to test the antibacterial effects of it,APG and those of the compound solution of them respectively.The results showed that the solution with concentration of more than 5.0 mg/mL MBL

24、 had effective anti-microbial activity.The solution containing 0.25 mg/mL1.0 mg/mL APG was almost ineffective on anti-microbial activity.5.0 mg/mL MBL plus with available 1.0 mg/mL APG(Compound Enzyme Prepration,CEP) could kill Escherichia coli,Staphylococcus aureus or Candida albicans.CEP was place

25、d in culture incubator for two weeks at 54 C,and then the rates of killing was no changed. We could conclude that CEP killed bacteria effectually,and the capability of CEP in killing bacteria was stable.To develop an new anti-PRV medicine from MBL,the anti-PRV effect of MBL in PK-15 cell culture was

26、 observed by means of the inhibition of cytopathic effect.The results showed that in PK-15 cell culture,MBL was found to be an inhibitor of PRV in a concentration-dependent manner.The median toxic concentration(TC50)of MBL was 100.0g/mL,the median effective concentration(EC50)of MBL was 0.46g/mL,the

27、 selectivity index(TI=TC50/EC50)is 217.In time of addition experiment,MBL inhibited the effect of PRV in PK15 cell when it was added at 0 h,2 h,4 h,6 h,and 8 h after virus infection.We could conclude that in PK-15 cell culture,MBL was found to be an inhibitor of PRV;In addition,MBL has good inhibiti

28、ng effect on NDV in vivo.Keywords:marine Bacillus S-12-86;antibacterial;antiviral;lysozyme刖言隨著抗生素生產(chǎn)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，在臨床上引起了兩個突出問題：一是細(xì) 菌的耐藥性逐年增加，致使一些抗生素的療效降低，甚至無效；另一個問題是一些不 致病的細(xì)菌成為條件致病菌，如變性桿菌、綠膿桿菌等，在臨床上已造成嚴(yán)重危害。 然而，人們同時又面臨著更為嚴(yán)峻的現(xiàn)實是病毒性傳染病已躍居傳染病之首，病毒性 傳染病已嚴(yán)重地威脅著整個人類的健康和生存。因而，篩選新型抗菌與抗病毒活性物 質(zhì)成為當(dāng)務(wù)之急！溶菌酶廣泛存在于各類生物

29、組織和分泌物中，其中在雞蛋清中含量最為豐富，含 量的占蛋清總量的3.4%-3.5%。溶菌酶是一種生物催化劑，具有多種用途，在食品 工業(yè)上，用做食品防腐劑，是嬰兒生長發(fā)育必不可少的抗菌蛋白，作為雙歧桿菌的增 殖因子，直接或間接促進(jìn)嬰兒腸道雙歧乳桿菌的增殖，促進(jìn)嬰兒胃腸道內(nèi)乳酪蛋白形 成微細(xì)凝乳，有利于嬰兒消化吸收。在醫(yī)藥臨床上的應(yīng)用：溶菌酶能參與人體的多糖 代謝，加速粘膜組織的修復(fù)；它能分解粘厚蛋白，降低膿液或痰液的粘度使之變稀而 排出；它能與血液中的抗凝因子結(jié)合，具有止血作用，還能提高抗菌素和其它藥物的 醫(yī)療效果。在生物工程上的應(yīng)用：溶菌酶具有破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的作用，用它溶解菌體 或細(xì)胞壁可獲得

30、細(xì)胞內(nèi)容物或原生質(zhì)體等，也可用于細(xì)胞融合或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以達(dá)到 生物育種的目的。溶菌酶又是生物體內(nèi)一種重要的免疫因子，無毒、無污染又具有一些明顯的殺菌、 抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞等功效，因而有著非常重要的應(yīng)用價值。初步估算，目前世界每 年溶菌酶總產(chǎn)量為300噸，需求量卻為1000噸，現(xiàn)行的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市場的需要。 目前，我國溶菌酶的年需求量150噸，現(xiàn)在國內(nèi)供貨量僅約30噸，所以市場容量很 大。市場價格與溶菌酶含量有很大關(guān)系，含量越高，價格也越高。根據(jù)掌握的資料， 美國Sigma公司的溶菌酶結(jié)晶，42000單位/毫克，價格為每公斤6000美元。丹麥sanovo 公司的溶菌酶結(jié)晶，25000單位/毫克

31、，價格為每公斤1500美元。由此可見，溶菌酶 開發(fā)研究具有著重要的應(yīng)用價值和商業(yè)價值。我國尚缺乏生產(chǎn)溶菌酶的規(guī)?；髽I(yè)， 溶菌酶年產(chǎn)量不過幾十噸。溶菌酶的高端產(chǎn)品主要被加拿大、美國、日本等國的大公 司所壟斷，我國的溶菌酶產(chǎn)品只能作為低端的粗品原料出口，當(dāng)需要高端產(chǎn)品時還需要依賴 于高價從國外進(jìn)口，這些事實嚴(yán)重阻礙了我國溶菌酶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著人們 生活水平的不斷提高，對蛋類食品的需求量越來越大，用于提取溶菌酶的原材料（雞 蛋）也顯得捉襟見肘。另外，蛋清溶菌酶僅能選擇性地分解革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁， 非廣譜類抗菌物質(zhì)，只有與其它物質(zhì)復(fù)配后才具有殺滅革蘭氏陰性菌的作用，實際應(yīng) 用存在有一定的局限性。因

32、而，尋找開發(fā)新型來源、作用范圍更廣的溶菌酶成為當(dāng)前 研究的熱點(diǎn)之一。從微生物群中直接篩選出能產(chǎn)溶菌酶的菌株的研究逐漸興起。然而， 隨著陸棲微生物在抗生素、酶、酶抑制劑等生物活性物質(zhì)的大量開發(fā)和應(yīng)用，尋找新 種屬的微生物或特殊性狀的微生物來開發(fā)新型微生物天然活性物質(zhì)的難度越來越大， 于是人們開始把目光越來越多地投向海洋微生物，試圖從海洋微生物的代謝產(chǎn)物中發(fā) 現(xiàn)和尋找性質(zhì)穩(wěn)定，功能特殊的目的產(chǎn)物。由于海洋特殊的低溫環(huán)境，海洋微生物所 產(chǎn)生的生物酶，與相應(yīng)的陸生動、植物所產(chǎn)生的酶相比在低溫條件下有相對高的活力， 其主要特征是具有較低的活化能。因而，來源于海洋微生物的酶類物質(zhì)在工業(yè)應(yīng)用和 基礎(chǔ)研究諸多

33、方面有著獨(dú)特的應(yīng)用前景。在此背景下，本課題組已獲得一株產(chǎn)溶菌酶的海洋芽抱桿菌S-12-86，并展開了 該菌所產(chǎn)溶菌酶的研究，該溶菌酶具有嗜低溫，抗氧化及溶菌譜廣等特點(diǎn)，對革蘭氏 陰性菌、革蘭氏陽性菌以及真菌均有抑菌作用，有望應(yīng)用于醫(yī)藥，食品工業(yè)及生物高 新技術(shù)等領(lǐng)域。在此基礎(chǔ)上，本論文對海洋芽抱桿菌S-12-86溶菌酶的發(fā)酵、純化和 生物活性進(jìn)行較為系統(tǒng)地研究。論文第一章以研究歷史為軸簡述了溶菌酶的發(fā)展過 程，以分類法綜述了海洋微生物抗菌抗病毒活性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀；第二章為海洋芽抱 桿菌S-12-86溶菌酶的發(fā)酵條件的優(yōu)化；第三章為海洋芽抱桿菌S-12-86溶菌酶的純 化與酶學(xué)性質(zhì)的研究；第四章

34、探討了海洋芽抱桿菌S-12-86溶菌酶的抑菌作用；第五 章對海洋芽抱桿菌S-12-86溶菌酶的體外與體內(nèi)抗病毒作用進(jìn)行了初步研究。MBL發(fā)酵條件的優(yōu)化溶菌酶(Lysozyme)，又稱細(xì)胞壁水解酶，能專一性地作用于細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚子，能使N-乙酰胞壁酸與乙酰葡萄糖氨之間的8 -1.4糖苷鍵斷裂，使細(xì)菌細(xì)胞壁變 松馳而達(dá)到溶解細(xì)菌的效果。溶菌酶廣泛分布于高等動植物組織及其分泌物、原 物、昆蟲、植物以及各種微生物中1。溶菌酶可以在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用，如在 治療中，溶菌酶能參與人體的多糖代謝，加速粘膜組織的修復(fù)，并具有抗感染與 毒的作用，能與血液中的抗凝因子結(jié)合，具有止血作用；還能提高抗菌素和其它 的醫(yī)

35、療效果207；在食品工業(yè)上，溶菌酶常用于食品的保鮮防腐208；在畜禽養(yǎng)殖 常與抗生素聯(lián)合使用，能促進(jìn)腸道有益細(xì)菌如乳酸菌的繁殖等作用209,210；在生 程方面，常用于原生質(zhì)體選育優(yōu)良菌種、分子遺傳研究等211。目前，市場上見到最多的溶菌酶是蛋清溶菌酶。隨著人們生活水平的提高，菌酶的需求量越來越大，單靠從雞蛋清中提取溶菌酶，很難解決市場供需矛盾2 然而，利用微生物生產(chǎn)溶菌酶，成本較低，節(jié)省材料，對環(huán)境污染較小，容易實 ?；a(chǎn)，因而開發(fā)潛力巨大。另外，由于微生物來源的溶菌酶有明顯的溶菌特異 根據(jù)其底物的不同來研究微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，溶菌酶又是一種非常有用的生物工1。多數(shù)微生物溶菌酶對金黃色葡萄球

36、菌、革蘭氏陰性菌和真菌有溶解作用，而清溶菌酶對以上菌株無明顯溶菌作用212,94，近年來，國內(nèi)外對多種微生物來源 菌酶進(jìn)行了廣泛而深入地研究。本課題組從東海海域底泥中篩選得到一株能夠產(chǎn) 酶的菌株(編號為S-12-86)。該菌株細(xì)胞呈桿狀，兩端鈍圓，大小為(0.6-0.8)M mX(2.0-5.0川m，以周生鞭毛運(yùn)動，無莢膜，該菌株革蘭氏染色幼齡為陽性，老變，偶爾能觀察到橢圓形的芽抱，芽抱囊無明顯膨大嚴(yán)格好氧。通過對菌株S-1 形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列進(jìn)行的多相分類研究 現(xiàn)該菌株具有典型的短芽抱桿菌屬的形態(tài)學(xué)特征，16S rDNA序列與短芽抱桿菌 部分菌株序列同

37、源性達(dá)93%-98%213。該菌所產(chǎn)生的溶菌酶在低溫下具有較高活對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及真菌等均有抑制作用214。本文擬采用搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的方法，初步摸清MBL產(chǎn)生菌的最適培養(yǎng)條件，然通過中試生產(chǎn)驗證搖瓶優(yōu)化條件，為MBL規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)；并將該菌產(chǎn)酶條與其它來 源溶菌酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行比較，分析其放大生產(chǎn)的可行性。與其它來源溶菌酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行比較，分析其放大生產(chǎn)的可行性。1材料與方法1.1菌種MBL產(chǎn)生菌株S-12-86由本實驗室分離保存，溶壁微球菌(購自Sigma公司)。1.2培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基：胰蛋白豚10.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L

38、，pH 7.0；斜面培養(yǎng)基：胰蛋白豚10.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH7.0。1.3主要試劑和儀器試驗用牛肉膏、蛋白豚、瓊脂、無機(jī)鹽類與其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗 用儀器包括722型光柵分光光度計，HTACHI20PR-52D高速冷凍離心機(jī)， SC5-24SHAKER恒溫培養(yǎng)搖床，SW-GJ-IB標(biāo)準(zhǔn)超凈工作臺，LKB型恒溫水浴等。1.4 MBL發(fā)酵培養(yǎng)條件從斜面挑取2環(huán)產(chǎn)酶菌到盛有3 mL種子培養(yǎng)基的試管中，30C，搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)18 h，然后按照一定的接種量轉(zhuǎn)入搖瓶中30C，250 r/min培養(yǎng)

39、 24 h （除特別注明外）。1.5 MBL活性的測定方法采用打孔法測定，即在冷凝瓊脂平板上（內(nèi)徑為90.0 mm的平板內(nèi)盛有20.0 mL含有0.01%溶壁微球菌），用內(nèi)徑為7.0 mm的打空器打孔，每孔加入待測樣品20.0以L， 30C保溫培養(yǎng)24 h，觀察并記錄溶菌圈的直徑，并通過標(biāo)準(zhǔn)溶菌酶樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線， 再換算出待測樣品的活力單位（U/mL）215。1.6菌株S-12-86產(chǎn)溶菌酶條件的篩選1.6.1碳源篩選分別用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油及甘露醇作為碳源物質(zhì)，按照濃度為20.0 g/L的添加量配制培養(yǎng)基，設(shè)不添加碳源物質(zhì)為對照，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，30C，250 r/min，發(fā)酵培

40、養(yǎng)24 h后，取樣測定酶活力（U/mL）。1.6.2氮源篩選分別用牛肉膏、酵母膏、蛋白豚、硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨和尿素作為氮源物質(zhì)， 添加量為10.0 g/L進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，設(shè)不添加氮源物質(zhì)為對照組，30C，250 r/min，發(fā) 酵培養(yǎng)24 h后，取樣測定酶活力（U/mL）。1.6.3金屬離子篩選參照文獻(xiàn)216，在培養(yǎng)基中，分別加入濃度為0.001 mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、 MgSO4、FeSO4、ZnCl2及CuSO4，設(shè)不添加離子為對照，30C，250 r/min，發(fā)酵培 養(yǎng)24 h后，取樣測定酶活力（U/mL）。1.6.4最適起始pH值篩選將培養(yǎng)基的起始pH值調(diào)至5.0

41、、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，接種菌體，30C，250r/min，培養(yǎng)24 h后，測定酶活力（U/mL）；1.6.5最適接種量篩選在含25 mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中分別按1.0% (v/v)、2.0% (v/v)、4.0% (v/v)、 6.0%(v/v)、8.0%(v/v)、10.0%(v/v)和 12.0%(v/v)的接種量接入菌體種子，30 C, 250 r/min，培養(yǎng) 24 h，測定酶活力(U/mL)；1.6.6最適裝液量篩選在 250 mL 三角瓶中分別加入 10 mL (4.0%, v/v)、15 mL (8.0%, v/v)、25 mL(10.0%, v/v)、35

42、 mL (14.0%, v/v)、45mL (18.0%, v/v)、55 mL (22.0%, v/v)、35 65 mL (26.0%, v/v)培養(yǎng)基，接種后，30C, 250 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，取樣測 定酶活力(U/mL)。1.6.7最適培養(yǎng)溫度篩選分別在 20C、25C、28C、30C、32C、35C溫度下，接種后，250 r/min,發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，取樣測定酶活力(U/mL)。以上每組實驗重復(fù)三次，依次從每一組實驗中篩選出最適條件。1.6.8生長曲線與產(chǎn)酶曲線的測定將菌株S-12-86培養(yǎng)50 h,每隔3 h取菌液，按照一定的稀釋倍數(shù)，測定其在OD550 nm處的

43、光吸收值(反映菌體數(shù)量)與酶活力。以橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時間，縱坐標(biāo) 為酶活力，次縱坐標(biāo)為菌體在OD550 nm處吸光值，繪制菌體的生長曲線與產(chǎn)酶曲線。1.6.9數(shù)據(jù)處理實驗數(shù)據(jù)用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(土SD)表示，使用Excel中的t檢驗分析數(shù)據(jù)差 異顯著性。1.7菌株S-12-86與其他產(chǎn)溶菌酶微生物產(chǎn)酶條件的比較將菌株S-12-86與文獻(xiàn)1中已報道的產(chǎn)溶菌酶微生物(如白色鏈霉菌G、灰色鏈 霉菌P-51、枯草芽抱桿菌77等)的產(chǎn)酶條件進(jìn)行比較。1.8中試發(fā)酵將搖瓶發(fā)酵優(yōu)化條件，應(yīng)用于中試生產(chǎn)上。中試種子罐總體積100 L，發(fā)酵液位40 L,發(fā)酵罐總體積為1000 L，發(fā)酵液體積為400 L，通氣量為1：

44、 0.3,發(fā)酵培養(yǎng)12h后將通氣量調(diào)至1： 0.6，攪拌軸轉(zhuǎn)速為75轉(zhuǎn)/分鐘。362結(jié)果與分析 2.1碳源對產(chǎn)酶的影響carbonsoiTDcef1.葡恂衲carbonsoiTDcef1.葡恂衲Ghros :工麥年血卻 M.至即Mtkio沮 4.淀物StmR 5.1汕EJlycerol : 6 . H 謠 tr?:Mwnitnl： 7 .牛I散 Hi 無時iM Control groi中 wiMat caibotii smwc ehab * 3rHM 號巨/圖21 誨將擄月MBL發(fā)悄的霧響Fig2-1 Hue effect of c rbaii saircef oix MBL f enu ai

45、taiiaix注=an匕is字母不同哲克同塞示存在顯著性差異Po.o5-Note:站ihue,wiflidiBfwentLefttsiilleuifigiifkuidLdiffereiuce (PD.O5j山2-1 mJ以看出，麥莎糠、淀粉、甘抽和葡萄糠均可被偏體5-D-86利用-而由格與甘霸障則不適合作為碳源，其中麥芽哄優(yōu)于淀粉、II.汕利匍布袖-H!是使用麥芽鞭作為I.業(yè)發(fā).產(chǎn)晾料.成本皎高，明顯不太合尊.相比之下-翻費(fèi)鞋是暗排S-12-86生長制產(chǎn)陸城為適：|：的棋曲.2.2氯源對產(chǎn)酶的影響III W 2-2 檔體5-123-36利用有機(jī)航曲的能力遠(yuǎn)強(qiáng)于利用無機(jī)ML源 牛肉片、附附怦、蚩

46、白腺和硫蟀均可被甫偉5-185利用,其中牛閩膏敦果最佳，蛋f仙，、 蔬曜和酵母膏質(zhì)之,從藤科價格I.來看，蚩白腺堊比牛肉膏俚宜的布,所以選擇蚩 門腺作為如源物質(zhì)進(jìn)行F如實驗,JJ褪說詢期 iutrogeifaiTKef1.牛肉肯 Beef extrart ；Tftist extract： 3巷 口聆 Tryptoiue； 4.破櫻玻 Ainmaniim FiiIatE：Pfftassiim irtrate： &機(jī)化玻加imaniL皿 Chbriie； 7母威 面財，州.眥fl 無RiW Caitrolgpngj vrithjMtEiiirogerL smnxe f1*12-2 ht?誨將戰(zhàn)村知

47、BL發(fā)柑的野響Fig.2-2 Effect of lutrogeii saircef oil MBL f ena2.3碳源與氯源最嵯濯度的確定在普通晉養(yǎng)培壽基的基黜匕分別砒I 1：濃度EFJ葡萄捕或蚩頑,進(jìn)藏發(fā)時-以納次棋游物質(zhì)那帔施物質(zhì)的國適濃度-皓果虬占24,山表24可以看出，VI萄椎的濃聲時器菌產(chǎn)酶的恨響比蚊明顯，其含也1低或過，如切上科向話慚I、 * .I 2 ；， 卜 事5 :.：.：. .： .：度1門捉描血逐漸降愜：隨著蛋I勺腺沌膜伯握高港菌監(jiān)的產(chǎn)典淅F陣，1僧體量卻隨之升高.說明提高氮源有利于菌/的大fit紫升,但是氮能物質(zhì)會影響升高暢產(chǎn)fit II勺下 降,故犒蚩白臆袱度布幽

48、在1 %以內(nèi)散為合適.也41辟誨，毓面最佳醵度的精定Table 2-1 Hue qptiniiiiiL taDjcentiMimaf carbai soirees ariutrogai stmreesoil MB L feniieiTto.tiM.1ifB： 7 + SD明別燃度CencLirhTL用活忤 EiLiyme idiviiy苗伴tji. c*l妙Ei切Ckai(菖/LUmL Sfflnrr.5.01(519 田=1159.0”0.3SSfcOJ032x10JO1-054 j(5 1021.0JO.2SOOJ019J20 JO2090302153.00.2750033-Ijhuofe

49、40 JO14982 4 1351,0:l0.2700025son1062： ,4 IB 1.0-0.1450D235.021442 3 1954.O0.085iOJ011SDK10JO202 IS.Qt1151.OO.EOOJ02rTryptoaxe20 JO11803 J8 1008 .O10315OJ03S40 JO10882,4 1105 .O10.350OJ029Json10技3 .好0.3751=0 J041-注=n上折字蝦不同者宜同襄示存在顯著性占抻Po.o5iNote: Wiijef wifl.1 differentcrts iiiue some 敞 duawsigiifi?q

50、ldifferaue (P：D)1101.251.250522025251J0305 JO5 JO2 JO正交試驗結(jié)果表交實駛結(jié)果與分析Table 2-4 The result and analysis of orthogonal test on fanientation n=3： XSD實駛編號No.ABCD前活性Enzyme activity/UmL11111110060.3 1151.2122210000.01013.03133323679.22155.0b4212j7P43.S657.0522139413.0854.06233120417.82356.0b1313110P64.8111

51、5.08321211748.81357.09332318197.l1755.0b魅145801440.09656947.0140761120.6125571292.8125921289.0103871075.0120471141.7137941DD9.D13fi3714D9.0207651150.014fi861875 3144571150.0R19 新3.D2fi39754.719 叩 1588.0由表宮1一見，IMJ.的大小分刖為eaoqd,氮波物質(zhì)的濃度和Mg*勺濃度對 發(fā)酵產(chǎn)酶的影響較大,碳泱物質(zhì)濃度和C廣的派度次之；備因素適宜的配比為 A1B3C3D30表中

52、正好有該配比,酶活性23679.2 U/mLt說明該配比為最適產(chǎn)酶培 養(yǎng)基配比。綜仰以上各方面的因素，以AiBK扣m配方為基礎(chǔ),確立菌S-12-36 宜培養(yǎng)基組分為10.0葡俑地、5.0g/L蛋白豚.5.0 g/L MgSO4、 2.0 C&C2.6培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)酶的影響由圖2-3 M見,起始pH對S-12-86菌的生長和產(chǎn)酶均有較為明顯的影響。pH值 為7最適合菌體繁殖，而pH值為如時最適合菌體產(chǎn)酶。起始 pH initial pH-酶活 Eiizyiiue activity Y-菌體生長量 Cell growth quantity圖2-3培養(yǎng)基起始pH對產(chǎn)麗的影響Fig.2-3 Eff

53、ect of initial pH m culture medium on enzyme production2.7接種最對產(chǎn)酶的影響300000.6圖2-4接種量對產(chǎn)酶的影響250000.5SOOLir250000. 2.7接種最對產(chǎn)酶的影響300000.6圖2-4接種量對產(chǎn)酶的影響250000.5SOOLir250000. 1接種 14 mLsize mL- Bi 活 Eiizyiiue activity A商體生長蚊 Cell growth quantityFig. 2-4 The effect of inoculums size on

54、 enzyme production由圖24可見，4.0%的接種量較為適宜。隨著接種量的提高，菌體數(shù)量明顯提高 聯(lián)勢,菌體數(shù)量的堆多，怛是菖接種量皆過40%.后,菌體的產(chǎn)酶開始F降。2.8裝液量對產(chǎn)酶的影響裝液量 mL aenation niL-菌體生長械 Cell giuwth quantity卜隔活 Enzyme activity0 2-5裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig. 2-5 裝液量 mL aenation niL-菌體生長械 Cell giuwth quantity卜隔活 Enzyme activity0 2-5裝液量對產(chǎn)酶的影響Fig. 2-5 The effect of aeratio

55、n on enzyme production300 000. 7250 000.65000200000. 515000100 000. 2由圖2-5可見,菌S-12-86是一株好氧菌,隨著裝修量的增加,菌體生長量明顯 早一現(xiàn)出卜降趨勢，裝瞅量過箏過少都不利于菌S-12-86的產(chǎn)酶。在250 mL的擒瓶中 裝25 mL的培養(yǎng)基為宜,UU為10%的裝液量.2.9培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響由圖6可見，不同的溫度對產(chǎn)酶量和活性影響很大，在20-282圍內(nèi)菌體生IV量隨溫度的升帶而地大，但量的活性在30 X?最高,也就是說最適產(chǎn)酶溫度和最適 生任溫度并不一致,綜合考慮牛物量，產(chǎn)酶量，最優(yōu)發(fā)酵溫度迷擇30亳較為

56、適宜。2.10生長曲線與產(chǎn)酶曲線的刃定|：時間山 Giuwtli tinie/h-耕活 Enzyme activity Y-菌體生長量 Cell growth quantity2-72.10生長曲線與產(chǎn)酶曲線的刃定|：時間山 Giuwtli tinie/h-耕活 Enzyme activity Y-菌體生長量 Cell growth quantity2-7生長曲線與產(chǎn)酶曲線的測定Fig 2-7 The curve of cell gi_owth and enzyme production2000D150003000025000lOOOO5000由圖2-7 IfjALr菌S-l件6 土培養(yǎng)20 h就達(dá)到了對數(shù)生長穩(wěn)足期,I：培養(yǎng)24h, 達(dá)到產(chǎn)酶高峰