乳酸菌培養(yǎng)及誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1、嗜酸乳桿菌 試驗(yàn)方法 一株嗜酸乳桿菌產(chǎn)共軛亞油酸條件的優(yōu)化 J. 中國(guó)釀造，2009 1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基（脫脂乳培養(yǎng)基）12.0 g脫脂奶粉，蒸餾水100 mL, pH自然，115C滅菌20 min。2、MRS 固體培養(yǎng)基葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸膏5.0g, 無(wú)水乙酸鈉5.0g，磷酸氫二鉀2.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，MgSO4 7H2O 0.58g，MnSO4 H2O 0. 33g,瓊脂15g, pH 6.8左右，加蒸餾水至1000mL，121C滅菌20min。3、產(chǎn)酶培養(yǎng)基：脫脂乳培養(yǎng)基，并加入一定濃度的亞油酸來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)酶。出發(fā)菌株的活化及純化保藏的嗜酸乳桿

2、菌接種于液體MRS培養(yǎng)基，搖勻后置36C恒溫箱中培養(yǎng) 12h，接種于液體培養(yǎng)基中活化2次。劃線接種到MRS固體培養(yǎng)基，36C恒溫培*養(yǎng)36h，嗜酸乳桿菌在120r / min的狀態(tài)下培養(yǎng)有利于嗜酸乳桿菌的繁殖。長(zhǎng) 出單個(gè)菌落后，挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，確定是否純種。嗜酸乳桿菌的形態(tài)與菌落特征在 MRS 瓊脂培養(yǎng)基上需氧培養(yǎng) 48h 后，菌落微小，不規(guī)則，微隆起，有光 澤，灰白色，呈透明的玻璃霜花樣。 10 倍顯微鏡觀察表面凸凹不平，邊緣為絲 狀或卷發(fā)樣。革蘭氏染色后可見(jiàn)菌體呈短桿狀，單個(gè)或短鏈狀排列，革蘭氏染色 陽(yáng)性。肉眼觀察， 嗜酸乳桿菌菌落較小,平臺(tái)狀， 不規(guī)則、圓形凸起、邊緣整 齊、

3、質(zhì)地柔軟、灰白色、有光澤。1）500mL MRS 液體培養(yǎng)基2）5 個(gè) 250mL 的三角瓶，橡膠塞，牛皮紙，繩子3）5 個(gè)培養(yǎng)皿4）1 個(gè)接種環(huán)，酒精燈，打火機(jī)，酒精種子的制備活化的菌種接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于36C恒溫培養(yǎng)24 h,保藏備用。增菌培養(yǎng)基最佳接種量為3% （活菌數(shù)為108個(gè)/mL） 產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)用脫脂乳配成12%的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基，每250mL三角瓶中裝入100mL（含 12g脫脂乳、1.50%。亞油酸），加入1mL吐溫80, 115C滅菌30 min后，接入2 mL 種子液（每mL含菌體5X108個(gè)），36C培養(yǎng)36h。lOOmL三角瓶裝40mL的脫脂乳(含4.8g脫脂乳、1.5

4、0%。亞油酸)，將活化 后的菌種按3%接種(接種量為1.2mL),混勻，在36C下靜止培養(yǎng)36h。并添加 0.1%(m/v)的乳糖，0.1%的硫酸銨，0.1%的氯化鈉。1) 5個(gè)100mL的三角瓶第一次直接添加LA比較好，且LA添加量為1.50% 反應(yīng)溫度為 36C發(fā)酵時(shí)間為 36h第二次(回歸正交)每個(gè)試樣平行 3 次。(菌種接種量 2%、 3%、 4%、 5%、 6%)(發(fā)酵時(shí)間為 12h、 24h、 36h、 48h)(D-果糖添加量 0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%(m/v)果糖為產(chǎn)CLA的最佳碳源(硫酸銨添加量 0、 0.5%、 1.0%、 1.5%、 2.0%(m/v)

5、) 結(jié)合有機(jī)物牛肉膏更有利于乳酸菌的生長(zhǎng)， CLA 產(chǎn)量也最高。硫酸銨的添加量 增加CLA產(chǎn)量反而有所減少。銨離子被吸收會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH下降不利于CLA 的產(chǎn)生。探于國(guó)萍，寇秀穎.產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的選育及培養(yǎng)基的確定J.食品工業(yè) 科技，2005,26(5):60 62.(氯化鈉添加量 0、 0.05%、 0.10%、 0.15%、 0.20%(m/v) )(直接添加 LA 比較好，且 LA 添加量為 0.50%。、1.00%。、1.50%。、2.00% (v/v) (反應(yīng)溫度為 25C、 30C、 36C、 40C)(發(fā)酵時(shí)間為 12h、 24h、 36h、 48h)考察菌體接種量、亞油酸

6、(LA)的添加量、反應(yīng)溫度等因素對(duì)菌株嗜酸乳桿菌 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件的影響。分離純化培養(yǎng)結(jié)束后離心高速冷凍離心機(jī) (6000r/m ， 10min ， 4C )收集菌體細(xì)胞。 用蒸餾水洗滌 2次，離心后稱重，及得生物量。離心后加入 4倍體積的 pH4.0 的緩沖液混勻，以0.5%(m/v)的量添加溶菌酶(30 C保溫，1h)，然后再使用 超聲波細(xì)胞破碎儀(超聲3s，間歇4s，90次，400W)在冰水浴中進(jìn)行細(xì)胞破 碎。破碎完成后進(jìn)行離心 (8000r/m ， 10min ， 4C )，所得上清液及為粗酶液。 粗酶液的合成反應(yīng)取上述制取粗酶 液 5mL 加 2mLLA 乳 濁液底物(5% LA+5%

7、Tween80+90% pH4.0緩沖液，放入冰水浴中超聲 10min，功率400w)，放 在搖床中30C，120r/min反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，待測(cè)。共軛亞油酸的檢測(cè)脂肪酸的提取反應(yīng)后的溶液中加入 5ml 正己烷，充分震蕩萃取，靜置后待分層，收 集上清液，在正己烷溶液中加如無(wú)水NH3SO4吸水干燥。與30C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā), 去除有機(jī)溶劑，將余下的液體收集在試管中待測(cè)。GC-MS 檢測(cè)共軛亞油酸以未接入菌種、其他步驟和條件同上的情況下所得到的正己烷萃取液為參 比、正己烷為溶劑，于波長(zhǎng)200nm300nm處掃描樣品，觀察波長(zhǎng)233nm處有 無(wú)特征吸收峰。若在該波長(zhǎng)處有特征吸收峰者，表明其發(fā)酵液中有CL

8、A生成， 讀取波長(zhǎng)234nm處吸光度值，根據(jù)CLA標(biāo)準(zhǔn)曲線所得CLA濃度，計(jì)算發(fā)酵液 中 CLA 的生成量。用 UV-1600 可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)在 190nm 300nm 對(duì)共軛亞油酸進(jìn)行 波長(zhǎng)掃描，以確定其最大的吸收波長(zhǎng)。其波長(zhǎng)掃描圖如圖2.1 ，得其最大吸收波長(zhǎng) 233nm。圖 2.1 CLA 最大吸收波長(zhǎng)掃描圖Fig.2.1 Absorption wave maximum of CLA*張智，余 萍嗜酸乳桿菌的篩選及培養(yǎng)基的優(yōu)化J.中國(guó)乳品工業(yè),2007,35(6)：2527.陳洪儀，楊楠.嗜酸乳桿菌培養(yǎng)的研究J.現(xiàn)代食品科技,2009, 25(6):656 660.張浩，曹 健，張國(guó)

9、艷保加利亞乳桿菌中德亞油酸異構(gòu)酶的研究J.食品 研究與開(kāi)發(fā), 2006, 127(7): 102107.3.璘酸塩一-鈉-檸攝酸邂沖滝卩|U.2molAjNaHPOd(毫升)0.1 mol/L 檸様酸（毫升）2.21兩L0.602.41.24LK.762.)2.18L7.K22.83.171,6.83加4.1 L115.89工24.9415.063.45.7()14,306.4413,563.S7.IULZSO丄U7.7112.194J8.281 l.：r.;4.48.8?1 1.184rh9,3510.654主9.8610.145.01 D.309,701心OJmol/.MHPOa(毫n、U. Iim?l/L 檸檬戰(zhàn) 仇升）工二ID.729.2S5 411.15S.S55.611 60K.4U5.812.097 916.012.637.376.2IU26 786413.856.156.614.555.456.&15.4?4357.016.473.5?7.：門39.!.f，i7.J18.17i時(shí)7.618,731 277.R19.15LkS