新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、新一代基因測序技術(shù)原理及其在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第1頁 新一代基因測序技術(shù)(Next Generation Sequencing Technologies)是一系列在后問世新DNA測序技術(shù)。這些新技術(shù)使用不一樣以往化學(xué)測序法，依靠高度并行基因序列讀取方式，取得了令人難以置信DNA測序高通量。新一代基因測序技術(shù)能在數(shù)天內(nèi)完成第一代基因測序技術(shù)花費(fèi)1O年完成人類基因組測序。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第2頁 自問世起，不停發(fā)展新一代基因測序技術(shù)（NGS）在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了許多突破性發(fā)覺，推進(jìn)了基因組學(xué)革命，促進(jìn)新學(xué)科創(chuàng)建，如個(gè)人基因組學(xué)，細(xì)菌基因組流行病學(xué)

2、。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第3頁 基因測序技術(shù)起源與發(fā)展 新一代基因測序技術(shù)平臺介紹 新一代基因測序技術(shù)臨床應(yīng)用 腫瘤分子診療領(lǐng)域 腫瘤研究領(lǐng)域 遺傳病篩查領(lǐng)域 傳染病研究領(lǐng)域 細(xì)菌基因組流行病領(lǐng)域新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第4頁基因測序技術(shù)起源與發(fā)展20世紀(jì)70年代早期，分別在幾個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)室，以不一樣方法實(shí)現(xiàn)了基因測序 直到1977年，可靠基因測序方法Sanger測序法和MaxamGilbert測序法才問世 Sanger測序法因?yàn)槠湓噭└咝У投?，因而得到不停改進(jìn)，深入發(fā)展成依靠染色自動化分析基因測序法 ，完成了第一個(gè)人類基因組序列圖譜。該基因組序列圖譜不但能夠幫助

3、快速識別單個(gè)基因，而且為探索研究人類基因組主要區(qū)域提供了便利 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第5頁Sanger測序法不足對常規(guī)DNA測序來說太昂貴，太耗時(shí)。伴隨各種動植物基因組數(shù)據(jù)大量產(chǎn)生，科學(xué)家開始專注于基因個(gè)體多樣性，并嘗試用新方法來描述個(gè)體基因組 因?yàn)槌杀竞蜏y序數(shù)據(jù)輸出量限制，用Sanger測序法獲取不一樣個(gè)體基因組進(jìn)行大規(guī)模對比研究是不可行 從起，一系列新DNA測序技術(shù)，名為“新一代基因測序技術(shù)”， 不停得到開發(fā)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引發(fā)了許多突破性發(fā)覺，并徹底改變了基因組測序領(lǐng)域發(fā)展 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第6頁自動化Sanger方法被認(rèn)為是“第一代”基因測序技術(shù)

4、“新一代基因測序技術(shù)” (Next Generation Sequencing Technologies，NGS) 相對Sanger法，新一代基因測序技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)是能夠快速，低價(jià)地提供巨量基因序列數(shù)據(jù)。它們每次測序運(yùn)行能讀取堿基數(shù)高達(dá)百億。 能夠代替生物晶片去對基因定性、定量分析。 能夠快速測序全基因組，大規(guī)模對比研究不一樣個(gè)體基因組成為可能；新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第7頁起開始面世一系列新DNA測序技術(shù)有統(tǒng)一名稱 “新一代基因測序技術(shù)”。實(shí)際上各種新一代基因測序技術(shù)化學(xué)測序方法有著顯著不一樣，不過有3個(gè)共同特征 ：1. 新一代基因測序技術(shù)都能夠同時(shí)處理以百萬計(jì)基因序列讀取，這也

5、是它們能高通量地測序基因原因。 2. 新一代基因測序技術(shù)經(jīng)過PCR擴(kuò)增創(chuàng)建它們基因序列讀取片段庫，勞動強(qiáng)度大大低于傳統(tǒng)使用載體克隆Sanger測序。 3. 與自動化Sanger測序技術(shù)相比，新一代基因測序技術(shù)所產(chǎn)生讀長都比較短(35700堿基)。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第8頁NGS技術(shù)平臺介紹 Roche(454)GS FLX基因測序技術(shù) 首先對目標(biāo)DNA酶切短鏈進(jìn)行油包水PCR擴(kuò)增，然后以擴(kuò)增DNA酶切短鏈為模版來合成新DNA。當(dāng)對應(yīng)三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成DNA鏈上時(shí)，添加熒光素酶能產(chǎn)生光。依據(jù)閃光次序以及對應(yīng)加入dNTP，測序儀所攜帶軟件就能夠創(chuàng)建目標(biāo)D

6、NA模板詳細(xì)序列信息。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第9頁Sanger法是依據(jù)核苷酸在某一固定點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定堿基處終止，而且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)識，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束四組不一樣長度一系列核苷酸，然后在尿素變性PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而取得可見DNA堿基序列。新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第10頁諾貝爾獎(jiǎng)得主Frederick Sanger和Walter Gilbert 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第11頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第12頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第13頁IlluminaGenome Analyzer測

7、序技術(shù) 對目標(biāo)DNA酶切短鏈進(jìn)行擴(kuò)增是經(jīng)過橋式PCR來完成。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，芯片上目標(biāo)DNA片段簇被用來做為模版來合成新DNA鏈，四個(gè)差異化標(biāo)識熒光dNTP為每個(gè)目標(biāo)DNA片段簇復(fù)制提供原料。一旦單個(gè)dNTP被加入新合成DNA末端，此dNTP差異化標(biāo)識熒光就會被讀取并統(tǒng)計(jì)，由此實(shí)現(xiàn)邊合成邊測序。當(dāng)DNA延伸步驟完成，測序儀所攜帶電腦軟件程序就會分析每個(gè)目標(biāo)DNA簇序列，并完成各個(gè)短鏈序列對齊，以及目標(biāo)基因組組合 。新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第14頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第15頁 近年來，Illumina企業(yè)在基因測序儀行業(yè)一直占據(jù)主導(dǎo)地位，其產(chǎn)品占據(jù)60市場份額。

8、推出IlluminaGA測序儀，HiSeq2000,就是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)高通量大規(guī)模平行基因測序典范。HiSeq2000一次測序耗時(shí)為10天，能完成600億個(gè)堿基正確測序，試劑成本僅為24 000美元。Illumina企業(yè)在年推出測序儀，MiSeq，針對較小試驗(yàn)室和臨床診療市場，其數(shù)據(jù)輸出量小于推出HiSeq200。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第16頁Biosystems SOLID 基因測序儀 該測序技術(shù)采取了獨(dú)特以四色熒光標(biāo)識寡核苷酸連續(xù)連接反應(yīng)為基礎(chǔ)測序方法。詳細(xì)操作也是開始于油包水PCR擴(kuò)增連接在微珠上目標(biāo)DNA酶切短鏈。擴(kuò)增后，用共價(jià)鍵把微珠及其擴(kuò)增目標(biāo)DNA短鏈連接到芯片表面，

9、然后放置到SOLID基因測序儀緩沖液測試槽內(nèi)進(jìn)行DNA測序。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第17頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第18頁P(yáng)acific BioSciences企業(yè)PacBio RS測序儀 采取熒光素標(biāo)識dNTPs進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測序，又稱為SMRT技術(shù)(single molecule，real-time)，所以該企業(yè)PacBio RS為第3代DNA測序儀。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第19頁SMRT技術(shù)將DNA聚合酶固化在每個(gè)稱為ZMW 小池里，僅照射ZMW 底部30 nm區(qū)域，實(shí)時(shí)檢測熒光素標(biāo)識4種核苷酸摻入。利用其專有SMRT 芯片(SMRT c

10、el1)，內(nèi)含約75 000個(gè)ZMW，所以能夠同時(shí)對近75 000個(gè)單分子進(jìn)行平行測序。不一樣于傳統(tǒng)方法將熒光素標(biāo)識在核苷酸堿基上，SMRT技術(shù)核苷酸標(biāo)識在磷酸鏈上，防止了染料基團(tuán)干擾DNA聚合酶活性；一個(gè)核苷酸摻入后，DNA聚合酶切斷磷酸鏈，釋放出染料分子，降低了干擾信號。這些技術(shù)確保了PacBio RS能夠進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測序，讀長在1 000 bp以上，反應(yīng)時(shí)間從30 min到1 d。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第20頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第21頁Life Technologies企業(yè)Ion Torrent PGM 測序平臺 自然條件下，DNA聚合酶將1個(gè)核苷

11、酸摻入DNA鏈中，就會釋放1個(gè)H+ ，該 H+ 所帶電荷改變了溶液pH值，可供離子探頭檢測分析。 Ion Torrent測序又被標(biāo)榜為第4代測序技術(shù)。 無需熒光物質(zhì)標(biāo)識和使用高清楚度攝像頭，測序成本大幅降低，能在23 h內(nèi)完成。 模板讀長較短是其缺點(diǎn)。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第22頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第23頁自以來，使用新一代測序儀臨床試驗(yàn)數(shù)量有大幅度增加。有全基因組測序，也有全外顯子組測序，還有RNA測序和定向測序（targeted sequencing）。不論采取哪種測序方式，全部這些臨床試驗(yàn)都是為了發(fā)覺致病遺傳異常，而且依據(jù)這些異常信息來指導(dǎo)臨床診療工

12、作。與此同時(shí)，這些信息也有利于生物制藥企業(yè)開發(fā)出更多靶向治療藥品，也能夠幫助了解一些藥品產(chǎn)生耐藥性原因。 新一代基因測序技術(shù)臨床應(yīng)用 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第24頁新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第25頁 腫瘤分子診療領(lǐng)域 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第26頁BRCA是Breast Cancer Susceptibility Gene縮寫。BRCA基因變異最早被發(fā)覺與女性乳腺癌和卵巢癌發(fā)病有親密關(guān)系。BRCA1和BRCA2屬于抑癌基因，叫乳腺/卵巢腫瘤易感基因。正常細(xì)胞中，BRCA1和BRCA2能夠幫助DNA損傷修復(fù)和維護(hù)DNA完整，預(yù)防癌細(xì)胞產(chǎn)生。假如 BRC

13、A1/2產(chǎn)生基因變異，失去了這一保護(hù)，細(xì)胞產(chǎn)生癌變幾率大大增加。而BRCA2基因變異與男性乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌有親密關(guān)系。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第27頁38歲美國女星Angelina Jolie在紐約時(shí)報(bào)上發(fā)表了我醫(yī)療選擇一文，稱因?yàn)樽约簲y帶有變異 BRCA1基因，醫(yī)生預(yù)計(jì)她患上乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)87%，患上卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)50%，她母親在56歲時(shí)死于癌癥。朱莉說切除術(shù)后，她患上乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)已降至5%。未來有與安吉麗娜朱莉一樣擔(dān)憂女性就能夠借助 NGS技術(shù)進(jìn)行BRCA檢測，提早采取相關(guān)辦法。新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第28頁遺傳病篩查領(lǐng)域 新一代測序技術(shù)對于新生兒孟德

14、爾式遺傳病篩查項(xiàng)目也很有幫助。臨床醫(yī)生們通常都會依據(jù)表型與基因型關(guān)系進(jìn)行單基因遺傳檢測，以此來明確診療。不過孟德爾式遺傳病也能夠以非常復(fù)雜形式存在，同一個(gè)表型可能是由多個(gè)基因來決定，其中就有可能存在當(dāng)前還未被發(fā)覺基因。在這種情況下單基因檢測就顯得無能為力了，新一代測序技術(shù)處理起這種問題來卻毫不費(fèi)勁，能夠以極快速度完成這一切。新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第29頁腫瘤研究領(lǐng)域中應(yīng)用全基因組測序 Parsons等利用新一代基因測序技術(shù)對22例多形性膠質(zhì)母細(xì)胞進(jìn)行測序新發(fā)覺大部分年輕膠質(zhì)瘤病人和復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤病人在IDH1位點(diǎn)上均頻發(fā)突變。 Lin等用大規(guī)模平行測序法檢測多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和正常

15、腦組織基因，在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中篩選出4535個(gè)基因表示異常。 Lee等利用新一代基因測序技術(shù)對原發(fā)性肺癌和和相鄰正常組織完整序列進(jìn)行比較發(fā)覺超出5萬個(gè)“點(diǎn)突變”，其中530個(gè)得到確認(rèn)：深入觀察發(fā)覺激酶基因發(fā)生氨基酸突變概率較高。新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第30頁全基因組小分子RNA(miRNA)分析 傳統(tǒng)芯片技術(shù)在檢測miRNA時(shí)面臨序列短、高度同源等難題，而新一代基因測序技術(shù)利用miRNA序列短及其本身高通量優(yōu)勢，能發(fā)覺更多miRNA。 Schulte等利用SOLID新一代基因測序技術(shù)對良性和惡性神經(jīng)母細(xì)胞瘤中miRNA表示進(jìn)行測序，經(jīng)過聚類分析提醒：二者miRNA表示差異顯

16、著，二者miRNA轉(zhuǎn)錄組也有顯著差異。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第31頁腫瘤全轉(zhuǎn)錄組分析 轉(zhuǎn)錄水平是調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖主要方法。在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮主要作用。而利用新一代測序技術(shù)能高通量地判定腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組改變，為腫瘤研究提供主要信息。 An等利用SOLID新一代基因測序技術(shù)對正常眼葡萄膜黑色素細(xì)胞和眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行檢測，經(jīng)過選擇性對5155個(gè)已注釋參加細(xì)胞通路、周期、凋亡和細(xì)胞黏附連接基因進(jìn)行詳細(xì)分析判定出21個(gè)基因在正常眼葡萄膜黑色素細(xì)胞和眼葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中表示有差異這21個(gè)基因可能參加眼葡萄膜黑色素瘤發(fā)生。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第32頁基因甲基化檢測 基因甲基化已經(jīng)成為腫瘤分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)之一，利用改良甲基化特異數(shù)字化核型分析法能敏感測出全基因組DNA甲基化位點(diǎn)，且含有高通量、低成本優(yōu)勢。 新一代基因測序技術(shù)原理及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第33頁新一代基因測序技術(shù)在腫瘤研究中發(fā)展前景 新一代基因測序技術(shù)在腫瘤研究中處于起始階段，基本上局限于腫瘤分子生物學(xué)方面研究，經(jīng)過高通量大規(guī)模檢測腫瘤細(xì)胞中基因組及RNA水平改變來