產(chǎn)品無菌檢驗操作規(guī)程

1、PAGE PAGE 11文件編號號： 產(chǎn)品無菌菌檢驗操操作規(guī)程程編制 日期審核 日期批準(zhǔn) 日期版號 生效日日期 公司公公司文件編號號版本號產(chǎn)品無菌菌檢驗修改次數(shù)數(shù)0作業(yè)指導(dǎo)導(dǎo)書頁次/1目的通過無菌菌檢驗，確保滅滅菌后產(chǎn)產(chǎn)品能夠夠達到無無菌的要要求。2適用范范圍適用于滅滅菌后醫(yī)醫(yī)療器械械產(chǎn)品（列列舉）的的無菌檢檢驗。3檢驗依依據(jù)本廠產(chǎn)品品注冊標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)（編編號）EN11174-19996醫(yī)療療器械滅滅菌產(chǎn)品品中微生生物數(shù)量量的評估估中國藥藥典（20005年版版）GB1442333.2-20055醫(yī)用輸輸液、輸輸血、注注射器具具檢驗方方法第二二部分：生物試試驗方法法GB1559800-19995一一次

2、性使使用醫(yī)療療用品衛(wèi)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)4儀器、設(shè)備百級層流流超凈工工作臺、電熱干干燥箱、電熱恒溫溫培養(yǎng)箱箱、霉菌菌培養(yǎng)箱箱、壓力力蒸汽滅滅菌器、集菌儀儀（器）、電子天天平、PPH計、冰箱、恒溫水水浴鍋、酒精燈燈、三角角燒瓶，接種環(huán)環(huán)、無菌菌棉簽、鑷子，試管架架，大試試管若干干等。5無菌檢檢驗室的的環(huán)境要要求5.1 無菌檢檢驗應(yīng)在在環(huán)境潔潔凈度1100000級下下的局部部百級的的單向流流空氣區(qū)區(qū)域內(nèi)進進行。5.2 緩沖區(qū)區(qū)與外界界環(huán)境、無菌檢檢驗室與與緩沖區(qū)區(qū)之間空空氣應(yīng)保保持正壓壓，陽性性對照室室與緩沖沖區(qū)之間間空氣應(yīng)應(yīng)保持負(fù)負(fù)壓。無無菌檢驗驗室與室室外大氣氣之間靜靜壓差應(yīng)應(yīng)大于110Paa。無菌菌檢

3、驗室室的室溫應(yīng)保持118226，相對對濕度：4565%。5.3無無菌檢驗驗室的單向流流空氣區(qū)區(qū)、工作作臺面及及環(huán)境應(yīng)應(yīng)定期按按醫(yī)藥藥工業(yè)潔潔凈室（區(qū)）懸懸浮粒子子、浮游游菌和沉沉降菌的的測試方方法的的現(xiàn)行國國家標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)進行懸懸浮粒子子、浮游游菌和沉沉降菌的的監(jiān)測。每年至至少檢測測一次。5.4 無菌檢檢驗過程程中應(yīng)同同時檢查查超凈工工作臺單單向流空空氣中的的菌落數(shù)數(shù)：每次操操作時在層流流空氣所所及臺面面的左中右右置3個個營養(yǎng)瓊瓊脂平板板，暴露露30mmin，于300355培養(yǎng)448小時時，菌落落數(shù)平均均應(yīng)不超超過1CCFU/平板。6 無菌菌檢驗前前的準(zhǔn)備備6.1 器具滅滅菌、消消毒6.1.1 滅滅

4、菌：試試驗過程程中與供供試品接接觸的所所有器具具必須采采用可靠靠方法滅滅菌?？煽山?jīng)電熱熱干燥箱箱1600以上干干烤2小小時，或或置壓力力蒸汽滅滅菌器內(nèi)內(nèi)1211蒸汽滅滅菌300分鐘后后使用（根據(jù)滅滅菌效果果驗證決決定滅菌菌參數(shù)）。所有有的滅菌菌物品不不應(yīng)超過過2周即即用畢，否則應(yīng)應(yīng)重新滅滅菌。6.1.2 消消毒：凡檢驗驗中使用用的器材材無法滅滅菌處理理的，使使用前必必須經(jīng)消消毒處理理。如無無菌檢驗驗室的試試管架、電子天天平、工工作臺面面、工作作人員的的手、橡橡膠吸頭頭等。可可采用消消毒劑浸浸泡或擦擦拭。消消毒劑應(yīng)應(yīng)每月更更換，以以防止產(chǎn)產(chǎn)生耐藥藥菌株。6.1.3標(biāo)識：器具的的滅菌、消毒后后必須

5、做做好標(biāo)識，標(biāo)標(biāo)明滅菌菌、消毒毒時間和和使用有有效期。6.2人人員、物物料進入入無菌檢檢驗室6.2.1 開開啟紫外外線燈或或臭氧發(fā)發(fā)生器進進行空間間滅菌處處理，消消毒時間間不得少少于300minn。6.2.2 物物料進入入無菌檢檢驗室流流程6.2.2.11 脫包包：進入無菌菌檢驗室室的物品品若有雙雙重包裝裝的，需需將外包包裝在傳傳遞窗/緩沖間間拆除后后，傳入入試驗室室。6.2.2.2 消毒：進入無無菌操作作室的所所有培養(yǎng)養(yǎng)基、供供試品等等的外表表都應(yīng)采采用適用用的方法法進行消消毒處理理，以避避免將外外包裝污污染的微微生物帶帶入無菌菌檢驗室室。6.2.2.3 傳遞：查看所所有進入入無菌檢檢驗室的

6、的器具上上的滅菌菌、消毒毒標(biāo)識，是否在在有效期期內(nèi)。符合要要求的經(jīng)經(jīng)傳遞窗窗傳入無菌檢檢驗室。6.2.3 人員員進入無無菌檢驗驗室流程程6.2.3.11 更鞋鞋脫衣：在一更更區(qū)脫去去一般區(qū)區(qū)工作鞋鞋，穿上上無菌檢檢驗室工工作鞋；脫去一一般區(qū)工工作服。6.2.3.22洗手：首先用用肥皂或或洗手液液在手上上揉擦出出泡沫，再用流流水連續(xù)續(xù)沖洗200秒，洗洗凈泡沫沫。6.2.3.33 更衣衣：在二二更區(qū)按按照從上上到下的的順序穿穿戴無菌菌工作服服（包括括衣、帽、口罩等等），要求褲子子掖在上上衣里，口罩掩掩住口鼻鼻，帽子子包裹所所有頭發(fā)發(fā)。6.2.3.44 手消消毒：用用消毒液液浸泡雙雙手5秒秒以上或或

7、用浸過過消毒液液的棉球球擦拭雙雙手。消消毒液可可用洗必必泰、新新潔爾滅滅、碘伏伏、755%酒精精等。6.2.3.55 人員員進入：經(jīng)緩沖沖間進入入無菌檢檢驗室。6.2.4 人人員進入入無菌檢檢驗室后后，進一一步用消消毒液擦擦拭工作作臺面，戴無菌菌手套。7 無菌菌檢驗操作作要求7.1全全過程必必須嚴(yán)格格執(zhí)行無無菌操作作，防止止微生物物污染。7.2 使用玻玻璃器皿皿應(yīng)輕取取輕放，避免破破損，以以防培養(yǎng)養(yǎng)物擴散散。7.3所所有操作作均應(yīng)在在近火焰焰區(qū)進行行，且不不得有大幅幅度或快快速動作作，以免免攪動空空氣中的的塵埃微微粒。7.4 使用金金屬接種種器具時時，用前前、用后后均需灼灼燒滅菌菌。7.5 在

8、接種種培養(yǎng)物物時，動動作應(yīng)輕輕、準(zhǔn)，防止培培養(yǎng)物濺濺出，產(chǎn)產(chǎn)生汽溶溶膠，造造成污染染。7.6操操作過程程中所有有的帶菌菌物品，用后均應(yīng)應(yīng)作消毒毒、滅菌菌處理?？稍跈z檢驗過程程中隨用用隨時放放入消毒毒液缸內(nèi)內(nèi)浸泡或或消毒桶桶內(nèi)，或或在檢驗完成成后經(jīng)傳傳遞窗傳傳至一般般區(qū)，立立即用壓壓力蒸汽汽滅菌鍋鍋1211滅菌300分鐘。8培養(yǎng)基基制備8.1需需氣菌、厭氣菌菌培養(yǎng)基基（硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基）的制備備8.1.1所用試試劑酪胨（胰胰酶水解解）15.00g葡萄糖55.0gL-胱氨氨酸0.5g硫乙醇酸酸鈉0.5g（或硫乙乙醇酸）（0.3mll）酵母浸出出粉5.0g氯化鈉22.5gg新配制的的0.1

9、%刃刃天青溶溶液1.0mll瓊脂0.75g水10000mll8.1.2制備除葡萄糖糖和刃天天青溶液液外，取取上述成成分混合合，微溫溫溶解，調(diào)節(jié)ppH為弱弱堿性，煮沸，濾清，加入葡葡萄糖和和刃天青青溶液，搖勻，調(diào)節(jié)pH為77.10.2。8.1.3 硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)劑劑氧化層層的顏色色要求在供試品品接種前前，培養(yǎng)養(yǎng)基氧化化層的高高度不得得超過培培養(yǎng)基深深度的11/5，否剛需需經(jīng)1000水浴加加熱到粉粉紅色消消失（不不超過220分鐘鐘）迅速速冷卻，只限加加熱一次次，并應(yīng)應(yīng)防止被被污染。8.2霉霉菌培養(yǎng)養(yǎng)基（改改良馬丁丁培養(yǎng)基基）的制制備8.2.1所用用試劑胨5.00g酵母浸出出粉2.0g葡萄

10、糖220.0g磷酸二氫氫鉀1.0g硫酸鎂00.5g水10000 mml8.2.2制備備除葡萄糖糖外，取取上述成成分混和，微微溫溶解解，調(diào)節(jié)節(jié)pH值值約為66.8，煮沸，加葡萄萄糖溶解解后，搖勻勻，濾清清，調(diào)節(jié)節(jié)pH為66.40.22。8.3 還可使用用按處方方生產(chǎn)的的符合規(guī)規(guī)定的脫脫水培養(yǎng)養(yǎng)基，按按照使用用說明書書配制。8.4 培養(yǎng)基基配制后后應(yīng)盡快快滅菌，避免微微生物繁繁殖。一一般采用用高壓蒸蒸汽1221滅菌300分鐘。8.5 制備好的的培養(yǎng)基基應(yīng)在22255保存，在3周周內(nèi)使用用。8.6 培養(yǎng)基基的無菌菌性檢查查每批配制制的培養(yǎng)養(yǎng)基均應(yīng)應(yīng)進行無無菌性檢檢查（可可與產(chǎn)品品無菌檢檢驗同步步進行

11、）。檢查查時，每每批培養(yǎng)養(yǎng)基隨機機取不少少于5支支（瓶）培養(yǎng)114天，應(yīng)無菌菌生長。9 稀釋釋液、沖沖洗液的的制備9.1 0.11%蛋白白胨水溶溶液取蛋白胨胨1.00g，加加水10000mml，微微溫溶解解，濾清清，分裝裝后置入入壓力蒸蒸汽滅菌菌器內(nèi)，1211滅菌300分鐘后后，于4保存?zhèn)鋫溆谩?.2 pH77.0 氯化鈉鈉-蛋白白胨緩沖沖液取磷酸二二氫鉀33.566g、磷磷酸氫二二鉀7.23gg、氯化化鈉4.30gg、蛋白白胨1.0g，加水110000ml。微溫溶溶解，濾濾清，分分裝后置置入壓力力蒸汽滅滅菌器內(nèi)內(nèi)，1221滅菌300分鐘后后，于4保存?zhèn)鋫溆谩?.3 浸提介介質(zhì)：99g/LL無

12、菌氯氯化鈉溶溶液，可可直接從從有證單單位采購購大輸液液。10 對對照菌液液制備10.11無菌檢檢驗所用用的菌株株傳代次次數(shù)不得得超過55代。10.22取金黃黃色葡萄萄球的普普通瓊脂脂斜面培培養(yǎng)物，接種一一白金耳耳至營養(yǎng)養(yǎng)瓊脂培培養(yǎng)基內(nèi)內(nèi)，在33035培養(yǎng)18244h后備備用，同同時制備備0.99%氯化化鈉溶液液加入在在6支小小試管內(nèi)內(nèi)，每支支試管內(nèi)內(nèi)加9.0mll的0.9%氯氯化鈉溶溶液，在在壓力鍋鍋內(nèi)經(jīng)1121滅菌330miin備用用。將已已配好的的金黃色色葡萄球球菌培養(yǎng)養(yǎng)菌液取11.0mml加入入第一支支小試管管內(nèi)，稀稀釋成濃濃度1:10的的菌液；取第一一支試管管內(nèi)1.0m l菌液液加入第

13、第二支小小試管內(nèi)內(nèi)，稀釋釋成濃度度1:1000的菌液液，同法法稀釋成成濃度1:106（每mml含菌菌量1000CFUU）即可可。10.33 采用用平皿計計數(shù)法測測定活菌菌數(shù)。11 無無菌檢驗驗培養(yǎng)溫溫度硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基，置330335培養(yǎng)。改良馬丁丁培養(yǎng)基基，置223228培養(yǎng)。12 無無菌檢驗驗12.11 如產(chǎn)產(chǎn)品注冊冊標(biāo)準(zhǔn)中中明確“產(chǎn)品應(yīng)應(yīng)經(jīng)過一一個確認(rèn)認(rèn)過的滅滅菌過程程”，則執(zhí)執(zhí)行122.1項下下各項。12.11.1放放樣每個滅菌菌批次按按已驗證的滅滅菌工藝藝，在滅菌菌柜內(nèi)相相應(yīng)的位位置放置置適量菌片片，滅菌菌后對菌片進行行無菌檢檢驗。12.11.2 菌片貯貯存滅菌前、后菌片片

14、應(yīng)按菌菌片說明明書規(guī)定定條件保保存。（REVVEN公公司菌貯貯存溫度度為15527）12.11.3 接種開啟超凈凈工作臺臺單向?qū)訉恿鳎谠诖谁h(huán)境境下，分分別將滅滅菌后的的菌片成成對放入入已滅菌菌的硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基中中。同時以以金黃色色葡萄球球菌作陽陽性對照照，以未未接種的的硫乙醇醇酸鹽流流體培養(yǎng)養(yǎng)基和未未接種的的改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基作為為陰性對對照。12.11.4培培養(yǎng)陽性對照照管于3035細菌培培養(yǎng)箱培培養(yǎng)488722小時。其余硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基于于3035培養(yǎng)77天。改良馬丁丁培養(yǎng)基基于233288培養(yǎng)77天。12.11.5結(jié)結(jié)果判定定培養(yǎng)后，陽性對對照應(yīng)有菌生生長，陰性對

15、對照和被被檢樣品品未見需需氣菌、厭氣菌菌和霉菌菌生長的的為合格格。12.22 如產(chǎn)產(chǎn)品注冊冊標(biāo)準(zhǔn)中中明確產(chǎn)產(chǎn)品應(yīng)進進行無菌菌檢驗，則則執(zhí)行112.22.112.22.5。12.22.1 抽樣根據(jù)各自自的產(chǎn)品品注冊標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)和相相應(yīng)產(chǎn)品品出廠檢檢驗規(guī)程程的規(guī)定定，對成成品庫內(nèi)內(nèi)的產(chǎn)品品進行抽抽樣。一一般同一一個滅菌菌批產(chǎn)品品檢驗33111個單位位供試品品。12.22.2 供試液液準(zhǔn)備優(yōu)先采用用將供試試品或其其有代表表性的各各部分直直接投放放入培養(yǎng)養(yǎng)基內(nèi)培培養(yǎng)的方方法，如如供試品品不適宜宜直接投投放，可可按下列列方法制制備供試試液，應(yīng)應(yīng)使浸提提介質(zhì)充充分洗提提供試品品的浸提提表面，供試液液制備應(yīng)應(yīng)按無

16、菌菌操作法法進行，在制備備后2小小時內(nèi)使使用。根據(jù)供試試品具體體特性選選擇下列列方法：a) 管管類器具具：按管管內(nèi)表面面積每10cm2流過管管內(nèi)腔11ml浸浸提介質(zhì)質(zhì)，流量量約為110ml/minn，收集到到無菌的的容器內(nèi)內(nèi)。b) 容容器類器器具：按按容器內(nèi)內(nèi)表面積積每10cm2加入浸浸提介質(zhì)質(zhì)1mll的比例例，振搖搖數(shù)次。 c) 實實體類器器具：實實體類器器具按表表面及每每10cm2加入浸提提介質(zhì)11ml，振搖數(shù)數(shù)次。收集上述述沖洗液液或浸提提介質(zhì)于于無菌容容器中。12.22.3 接種12.22.3.1 薄薄膜過濾濾法：優(yōu)優(yōu)先采用用封閉式式薄膜過過濾器（集菌器器），也也可使用用開放式式薄膜過

17、過濾器。濾膜孔孔經(jīng)不大大于0.45。濾器器和濾膜膜使用前前應(yīng)采用用適宜的的方法滅滅菌，或或直接采采用無菌菌集菌器器。a、如采采用封閉閉式薄膜膜過濾器器，取一副副三聯(lián)式集菌器器，將供試試液通過過集菌儀儀過濾，使通過過每只培培養(yǎng)管的的量基本本均勻。然后通通過集菌菌儀一只只加1220mll改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基，另另兩只分分別加入入1200ml硫硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)基（其其中一只只做陽性性對照，內(nèi)加金金黃色葡葡萄球菌菌液1mll）。另另取一副副二聯(lián)集集菌器，用同批批的沖洗液液或浸提提介質(zhì)1120mml通過過集菌儀儀過濾（每只約約50mml），同法一一只加硫硫乙醇酸酸鹽培養(yǎng)養(yǎng)基1220mll，另一一只加改改

18、良馬丁丁培養(yǎng)基基1200ml分分別作陰陰性對照照。b、如用用一般薄薄膜過濾濾器，將將供試液液過濾后后取出濾濾膜，將將其剪成成3等份份，分別別置于含含50mml硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基及及改良馬馬丁培養(yǎng)養(yǎng)基的容容器中，其中兩兩份作檢檢驗，一一份作陽陽性對照照。12.22.3.2 直直接接種種法：適適用于一一次性使使用注射射針、一一次性使使用靜脈脈輸液針針（包括括輸液器器、輸血血器、注注射器配配套使用用注射針針）。a、敷料料供試品品：取規(guī)規(guī)定數(shù)量量，每個個包裝以以無菌操操作拆開開，于不不同部位位剪取約約1200mg或或1cmm3cmm的供試試品，接接種于各各管足以以浸沒供供試品的的適量培培養(yǎng)基中

19、中。b、無菌菌針頭：直接投投入含115mll以上硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基及改良良馬丁培培養(yǎng)基的的容器中中。c、一次次性使用用的材料料：拆散散或切成成小碎斷斷，接種種于各管管足以浸浸沒供試試品的適適量培養(yǎng)養(yǎng)基中。供試品按按規(guī)定量量分別接接種至各含硫硫乙醇酸酸鹽流體體培養(yǎng)基基及改良良馬丁培培養(yǎng)基的的容器中中，其中中一份作作陽性對對照。每個容器器中培養(yǎng)養(yǎng)基的用用量應(yīng)符符合：接種的的供試品品體積不不得大于于培養(yǎng)基基體積的的10%，或培培養(yǎng)基的的裝量足足以浸沒沒供試品品。每管培養(yǎng)養(yǎng)基的最最低用量量硫乙乙醇酸鹽鹽流體培培養(yǎng)基每每管裝量量不少于于15mml，改改良馬丁丁培養(yǎng)基基每管裝裝量不少少于100 mll.12.22.4 培養(yǎng)、觀察上述含培培養(yǎng)基的的容器分分別置規(guī)規(guī)定溫度度的恒溫溫培養(yǎng)箱箱中，除除陽性對對照管培培養(yǎng)488722小時外外，其余余管培養(yǎng)養(yǎng)14天天。培養(yǎng)養(yǎng)期間