核酸操作的技術(shù)

1、4 核酸操作的基本技術(shù)4.1 核酸的提取與純化4.2 核酸的檢測與保存4.3 核酸的凝膠電泳4.4 核酸的分子雜交核酸是基因工程研究的對象和材料，核酸操作技術(shù)的好壞對于基因工程的成敗可產(chǎn)生決定性的影響。4.1 核酸的提取與純化提取的目的：保持核酸的完整性。需要注意的方面： 細胞內(nèi)的核酸酶；化學(xué)因素；物理因素。4.1.1 基本原理4.1.2 微生物DNA的提取4.1.3 動物細胞DNA的提取4.1.4 植物細胞的提取4.1.5 核外DNA的提取4.1.6 RNA的提取4.1.1 基本原理組織細胞破碎去除雜質(zhì)（蛋白、糖類）去除其他雜質(zhì)核酸脫鹽、獲得純品步驟：化學(xué)試劑提取法：堿裂解法、煮沸法、有機溶

2、劑抽提法、去污劑法等1.CATB法：CATB（十六烷基三乙基溴化銨），能溶解細胞膜，與核酸形成復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液（0.7M NaCl）中可溶，降低鹽濃度（0.3M）即可沉淀。 很好的去除糖類；初期能同時分離DNA和RNA。2.SDS法：SDS（十二烷基硫酸鈉）在55-65下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用高鹽及降低溫度的做法或用酚氯仿法使蛋白質(zhì)變性，多糖沉淀，除去沉淀后用乙醇沉淀核酸。 操作簡單、溫和，可提取RNA和DNA，但糖類不易去除。離心分離法：超速離心、凝膠電泳超速離心：（a）速度區(qū)帶離心：蔗糖。 沉降速度與樣品質(zhì)量、密度、離心力大小、介質(zhì)密度及樣品與介

3、質(zhì)的摩擦力有關(guān)。（b）密度梯度離心:CsCl。 沉降速度與密度有關(guān)。 分辨率：0.02g/mL 蛋白質(zhì)：1.3g/mL DNA： 1.6-1.7g/mL RNA： 1.75-1.85g/mL4.1.2 微生物DNA的提取質(zhì)粒DNA提取細菌DNA提取病毒DNA提取質(zhì)粒DNA提取堿裂解法、煮沸法、去污劑裂解法。細菌培養(yǎng)菌體收集裂解離心去除沉淀酚氯仿抽提異丙醇沉淀細菌DNA的提取細菌細胞洗滌獲得純品懸浮細菌堿裂解或煮沸或去污劑酚氯仿抽提12000rpm離心上層水相中間變性蛋白下層有機相乙醇沉淀沉淀：63%乙醇（終濃度）洗滌：70%乙醇4.1.3 動物細胞DNA的提取組 織 勻 漿蛋白酶K消化RNas

4、e消化SDS裂解高鹽或酚氯仿抽提乙醇沉淀洗滌，獲得純品4.1.4 植物細胞的提取組 織 勻 漿CATB處理高鹽或酚氯仿抽提乙醇沉淀洗滌，獲得純品去除RNA4.1.5 核外DNA的提取組 織 勻 漿差速離心分離細胞器去除核DNA蔗糖密度梯度離心收集線粒體裂解線粒體DNA提取相關(guān)步驟4.1.6 RNA的提取總RNA提?。?常用方法：利用異硫氰酸胍裂解。mRNA提?。?在總RNA提取的基礎(chǔ)上進行親和層析。注意：RNase無處不在，需要做好實驗預(yù)處理。4.2 核酸的檢測與保存檢測： 紫外光譜分析法和熒光分析法。 A260=1相當于 50g/mL 雙鏈DNA保存： pH：TE； 溫度：-20，-80。4

5、.3 核酸的凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖場凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳分類：低熔點瓊脂糖和高熔點瓊脂糖。分辨率：差異高于200bp。指示劑：溴酚藍、二甲苯腈染色：EB緩沖液：TAE、TBE聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高：可分離相同長度堿基組成不同的DNA片段；需要樣品量少：銀染，可檢測少量樣品；回收DNA純度高；脈沖場凝膠電泳分離超大DNA分子： 1-10Mb用于基因組文庫構(gòu)建。4.4 核酸的分子雜交原理：A-T(U),G-C互補配對。 可形成DNA:DNA，DNA:RNA雙鏈分子。主要步驟： （1）核酸轉(zhuǎn)移； 電泳凝膠核酸印跡法、斑點印跡法、 狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法。 （2）探針雜交。探針的制備探針：經(jīng)放射性或飛放射性等物質(zhì)標記的已知或特定的DNA或RNA序列。探針種類