國(guó)家自然科學(xué)基金申請(qǐng)書

1、國(guó)家自然科學(xué)基金申 請(qǐng) 書（2 0 1 8版）資助類別：面上工程亞類說(shuō)明： 附注說(shuō)明：申 請(qǐng) 人：石群鋒電 話：依托單位：成都中醫(yī)藥大學(xué)通訊地址：成都市十二橋路37號(hào)郵政編碼：610075單位電話：電子郵箱：申報(bào)日期：2022年03月01日國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)工程名稱： 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)百草枯誘導(dǎo)肺纖維化中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路的調(diào)控機(jī)制爭(zhēng)辯根本信息誕生姓?名石群鋒性別男民族漢年月每年工作時(shí)間學(xué)?位碩士職稱教授8申（月）請(qǐng)電?話電子郵箱人信傳?真國(guó)別或地中國(guó)區(qū)息個(gè)人通訊地址成都市十二橋路37號(hào)工作單位成都中醫(yī)藥大學(xué)主要爭(zhēng)辯領(lǐng)域中醫(yī)藥防治呼吸與老年病的爭(zhēng)辯依名?稱成都中醫(yī)藥大學(xué)托單聯(lián)?系

2、?人XXXX電子郵箱XXXXXXXX位信電?話XXXXXX網(wǎng)站地址息合單?位?名?稱作爭(zhēng)辯單位信息補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)百草枯誘導(dǎo)肺纖維化中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子工程名稱項(xiàng)1/Smad3 通路的調(diào)控機(jī)制爭(zhēng)辯目基英文名稱本信資助類別面上工程亞類說(shuō)明息附注說(shuō)明申請(qǐng)代碼基地類別H0110：肺間質(zhì)性疾病H0111：急性肺損傷爭(zhēng)辯期限2022年01月2022年12月?tīng)?zhēng)辯方向：應(yīng)用根底爭(zhēng)辯申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)萬(wàn)元中?文?關(guān)?鍵?詞百草枯，肺纖維化，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3通路英?文?關(guān)?鍵?詞Paraquat, pulmonary fibrosis, transforming growth factor beta 1/Smad3 pa

3、thway中百草枯（Paraquat，PQ）化學(xué)名為 1，1”-二甲基 4，4”-二聯(lián)吡啶，分子式：CH3（C5H4N）2CH3Cl2，分子量：，自 1962 年開(kāi)頭作為除草劑被廣泛使用。文PQ 對(duì)人畜的急性毒性作用很強(qiáng)，且無(wú)有效解毒劑，中毒大事經(jīng)常發(fā)生，病摘死率居高不下。PQ 中毒后肺纖維化過(guò)程中，TGF-1/Smad3 的表達(dá)水平和功能狀態(tài)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，亦存在明顯的 EndoMT 現(xiàn)象，但這些細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)因子要與 EndoMT 的相關(guān)性及它們?cè)?PQ 導(dǎo)致肺纖維化過(guò)程中的具體生物學(xué)機(jī)制均尚未明白。PQ 致肺纖維化是基于直接毒性作用還是由免疫炎癥反響誘導(dǎo)所形成1。祝春青 的爭(zhēng)辯說(shuō)明已有成熟的注射

4、 PQ 肺纖維化模型方案，一次性腹腔注射百草枯可制備小鼠肺纖維化模型,40 和 50 mg/kg 為較適宜的造模劑量2。補(bǔ)陽(yáng)換物湯作為活血化瘀的代表方劑，多項(xiàng)爭(zhēng)辯說(shuō)明可延緩肺纖維化的進(jìn)程，并改善肺功能3。本爭(zhēng)辯擬承受逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反響(RT-PCR) 法檢測(cè) TGF-1mNA，Smad3 mNA 的表達(dá)。同時(shí)承受病理切片行 HE 染色和 Masson 染色，光鏡下觀看病理組織學(xué)變化并攝片，參照Szapiel4等方法評(píng)價(jià)各組大鼠肺組織肺泡炎程度及肺纖維化程度。并設(shè)想在以下幾方面深入爭(zhēng)辯：1、擴(kuò)大樣本量，確證其抗炎作用；2、延長(zhǎng)觀看時(shí)間，重點(diǎn)觀看后期的抗纖維化作用； 3、觀看其對(duì)成纖維細(xì)胞的作用

5、及其機(jī)制。國(guó)內(nèi)外目前未見(jiàn)同類報(bào)道。參考文獻(xiàn):陸遠(yuǎn)強(qiáng),姜久昆.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路和百草枯中毒所致上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變J. 中華危重癥醫(yī)學(xué)雜志(電子版),2022,10(3):145-148.祝春青,陳冬波,王喆,等.腹腔注射百草枯構(gòu)建小鼠肺纖維化模型 J.生物技術(shù)通訊,2022,23(4):563-566.楊晗,王飛,王全林,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織 TGF-1/Smad3 表達(dá)的影響J.中國(guó)試驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2022,19(24):240-244.Szapiel S V，Elson Na，F(xiàn)ulmer J D，et alBleomycin induced interstiti

6、al pulmonary disease in the nude，athymic mouseJAm Rev Respir Dis，1979， 120: 893.Paraquat (PQ) is chemically known as 1,1”-dimethyl 4,4”-bipyridine, the molecular formula: CH3 (C5H4N) 2CH3Cl2, molecular weight: , since 1962 as a herbicide has been widely used. The acute toxicity of PQ to human and an

7、imal isvery strong, and there is no effective antidote, poisoning events often occur, the mortality rate is high. In the process of pulmonary fibrosis after PQ intoxication, the expression level and functional status of TGF-beta 1/Smad3 will change, and there is also obvious EndoMT phenomenon. Howev

8、er, the correlation between these cells and transduction factors and EndoMT, and their specific biological mechanism in the process of pulmonary fibrosis induced by PQ are still unclear. PQ induced pulmonaryfibrosisisbasedondirecttoxicityor1inducedbyimmune inflammatory response. Zhu Chunqing”s resea

9、rch shows that there is a mature modelofpulmonaryfibrosisbyinjectionofPQ.Paraquatcanbeinjected intraperitoneallyoncetoestablishpulmonaryfibrosismodelinmice.Asa representative prescription of promoting blood circulation and removing blood stasis, Buyang Changwu Decoction can delay the process of pulm

10、onary fibrosis and improve pulmonary function. In this study, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the expression of TGF-beta 1 mRNA and Smad3 mRNA. At the same time, HE staining and Mason staining were used for pathological sections, histopathological changes

11、were observed and photographed under light microscope, and the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis in lung tissues of rats in each group were evaluated by Szapiel 4. And envisaged in the following areas: 1, expand the sample size to confirm its anti-inflammatory effect; 2, prolong the observ

12、ation time, focusing on the late anti-fibrosis effect; 3, observe itseffect on fibroblasts and its mechanism. No similar reports have been reported at home and abroad.Reference:Lu Yuanqiang, Jiang Jiukun. Transforming growth factor beta 1/Smads pathway and epithelial-mesenchymal transition induced b

13、y paraquat poisoning J.Chinese Journal of Critical Care Medicine (electronic edition), 2022, 10 (3): 145-148.Zhu Chunqing, Chen Dongbo, Wang Zhe, et al. Pulmonary fibrosis model of mice was established by intraperitoneal injection of paraquat J.Biotechnology Communication, 2022, 23 (4): 563-566.Yang

14、 Pi, Wang Fei, Wang Quanlin, et al. Effect of Buyang Huanwu Decoction on the expression of TGF-beta_1/Smad3 in lung tissue of pulmonary fibrosis rats J.Chinese Journal of Experimental Prescription, 2022, 19 (24): 240-244.Szapiel S V, Elson Na, Fulmer J D, et al. Bleomycin induced interstitial pulmon

15、ary disease in the nude, athymic mouse J. AmRev Respir Dis, 1979, 120:893.誕生年編號(hào)姓名性別職 稱學(xué) 位單位名稱電話電子月1XX教授博士成都中醫(yī)藥大學(xué)2XX博士生碩士成都中醫(yī)藥大學(xué)3主治醫(yī)成都中醫(yī)藥大學(xué)XX博士師4主治醫(yī)成都中醫(yī)藥大學(xué)XX碩士師5XX碩士生學(xué)士成都中醫(yī)藥大學(xué)6XX碩士生學(xué)士成都中醫(yī)藥大學(xué)總?cè)藬?shù)高級(jí)中級(jí)初級(jí)博士后7323工程組主要參與者（注: 工程組主要參與者不包括工程申請(qǐng)人）國(guó)家自然科學(xué)基金工程資金預(yù)算表(單位： 萬(wàn)元)序號(hào)科目名稱金額備注一、直接費(fèi)用1、 設(shè)備費(fèi)(1)設(shè)備購(gòu)置費(fèi)(2)設(shè)備試制費(fèi)(3)設(shè)備

16、改造與租賃費(fèi)SD大鼠，轉(zhuǎn)染，2、 材料費(fèi)RT-PCR，病理，芯片等3、 測(cè)試化驗(yàn)加工費(fèi)4、 燃料動(dòng)力費(fèi)5、 差旅/會(huì)議、國(guó)際合作與溝通費(fèi)學(xué)術(shù)會(huì)議，差旅費(fèi)文獻(xiàn)檢索，論文6、 出版/文獻(xiàn)/信息傳播/學(xué)問(wèn)產(chǎn)權(quán)10發(fā)表，郵費(fèi)，通事務(wù)費(fèi)訊費(fèi)等117、 勞務(wù)費(fèi)128、 專家詢問(wèn)費(fèi)139、 其他支出14二、 自籌資金來(lái)源預(yù)算說(shuō)明書(定額補(bǔ)助)（請(qǐng)按國(guó)家自然科學(xué)基金工程資金預(yù)算表編制說(shuō)明中的要求，對(duì)各項(xiàng)支出的主要用途和測(cè)算理由及合作爭(zhēng)辯外撥資金、單價(jià)10 萬(wàn)元的設(shè)備費(fèi)等內(nèi)容進(jìn)展具體說(shuō)明，可依據(jù)需要另加附頁(yè)。）申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)預(yù)算： 總共擬申請(qǐng)經(jīng)費(fèi) 40 萬(wàn)元人民幣。支出預(yù)算具體說(shuō)明如下：1、直接用于本工程爭(zhēng)辯的的費(fèi)用

17、共計(jì)萬(wàn)元人民幣，占總申請(qǐng)費(fèi)用的%，其中科研業(yè)務(wù)費(fèi) 12 萬(wàn)元人民幣，占總申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的%。7 萬(wàn)元用于病理標(biāo)本檢測(cè)、電鏡觀看、免疫組化、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)費(fèi)用等。其余7 萬(wàn)元分別用于能源、動(dòng)力、資料費(fèi)、信息費(fèi)、學(xué)術(shù)溝通差旅費(fèi)等。試驗(yàn)材料費(fèi) 10 萬(wàn)元人民幣，主要用于購(gòu)置體內(nèi)、外試驗(yàn)所需試劑、試劑盒、試驗(yàn)動(dòng)物、試驗(yàn)藥品和其他常用試劑等。試驗(yàn)室改裝費(fèi)萬(wàn)元，主要用于試驗(yàn)室修理、通風(fēng)條件的改善等。2、國(guó)際合作與溝通費(fèi)用：打算支出萬(wàn)元，占總申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的 20%。主要用于邀請(qǐng)國(guó)外學(xué)者來(lái)滬進(jìn)展課題爭(zhēng)辯溝通的局部旅差費(fèi)、講課費(fèi)以及工程組成員出國(guó)進(jìn)展學(xué)術(shù)溝通的旅差費(fèi)等。3、勞務(wù)費(fèi)：打算支出萬(wàn)元人民幣，占總申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的%。

18、主要用于參與本工程的爭(zhēng)辯生、技術(shù)人員等的勞務(wù)費(fèi)、加班費(fèi)等。4、治理費(fèi)：打算支出 2 萬(wàn)元，占總申請(qǐng)經(jīng)費(fèi)的 5%。按基金委財(cái)務(wù)治理規(guī)定提取.報(bào)告正文參照以下提綱撰寫，要求內(nèi)容翔實(shí)、清楚，層次清楚，標(biāo)題突出。 請(qǐng)勿刪除或改動(dòng)下述提綱標(biāo)題及括號(hào)中的文字。（一）立項(xiàng)依據(jù)與爭(zhēng)辯內(nèi)容（4000-8000 字）：工程的立項(xiàng)依據(jù)（爭(zhēng)辯意義、國(guó)內(nèi)外爭(zhēng)辯現(xiàn)狀及進(jìn)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)爭(zhēng)辯進(jìn)展趨勢(shì)來(lái)論述科學(xué)意義；或結(jié)合國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)進(jìn)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問(wèn)題來(lái)論述其應(yīng)用前景。附主要參考文獻(xiàn)名目）；百草枯( Paraquat，PQ)，商品名為克蕪蹤、對(duì)草快，化學(xué)名稱是 1，1”-二甲基-4，4”-聯(lián)吡啶二氯化物

19、，為聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，易溶于水。因其除草效果好被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)中，但隨之消滅的自服、誤服而導(dǎo)致的中毒大事的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢(shì)1。臨床上覺(jué)察，大劑量中毒患者多因多器官功能衰竭而急性死亡; 中小劑量中毒患者在度過(guò)急性肺損傷期，局部患者卻在后期因不行逆性肺纖維化所導(dǎo)致的呼吸衰竭而死亡，為后期主要死因。目前無(wú)有效治療方法，百草枯通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)肺纖維化，如氧化損傷、肺泡上皮損傷和型肺泡細(xì)胞凋亡和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)等，其中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，目前認(rèn)為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 ( transforming growth factor-，TGF-) 是致纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，其介導(dǎo)的Smad 通路是纖維化發(fā)生的可能機(jī)制

20、之一2，Smad3 家族中的 Smad3 是 TGF-/Smad3 信號(hào)通路活化蛋白，其正常表達(dá)與肺纖維化的形成直接相關(guān)。TGF- 被公認(rèn)為纖維化形成與進(jìn)展中最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子之一，是纖維化形成的啟動(dòng)樞紐3，也是目前所知最強(qiáng)的致纖維化因子。近年來(lái)，中醫(yī)藥防治肺纖維化的爭(zhēng)辯取得了肯定成就。爭(zhēng)辯覺(jué)察，益氣活血法能夠改善肺纖維化患者的臨床病癥和體征，并能延長(zhǎng)生存時(shí)間。補(bǔ)陽(yáng)還五湯 出自清代名醫(yī)王清任的醫(yī)林改錯(cuò)，是益氣活血法的代表方劑?，F(xiàn)代藥理爭(zhēng)辯說(shuō)明4，該方的各主要單味中藥均對(duì)試驗(yàn)性肺間質(zhì)纖維化具有良好的防治作用， 改善微循環(huán)，抑制過(guò)敏介質(zhì)的釋放，可延緩或阻斷肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程。補(bǔ)陽(yáng)還 五湯在防治肺纖維

21、化方面有著良好的應(yīng)用前景，但具體作用機(jī)制不明。楊晗 5 等的爭(zhēng)辯說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以通過(guò)調(diào)控 TGF-1/Smad3 信號(hào)通路中的 TGF-1， Smad3 過(guò)度表達(dá)，到達(dá)對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的治療作用。但補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)百草枯所致纖維化是否有效，以及用藥時(shí)機(jī)方面仍未有相關(guān)爭(zhēng)辯。主藥參考文獻(xiàn)：羅雅娟, 何旭. 百草枯中毒致肺纖維化的機(jī)制爭(zhēng)辯及治療現(xiàn)況J. 毒理學(xué)雜志, 2022(3).Bonniaud P，Margetts P J，Kolb M，et al Transient transgene expression of CTGFin the lung induces moderate an

22、d reversible fibrosis J Eur espir J，2002，20 ( 38) :378. 3 Verrecchia F， Mauviel A Transforming growth factor-beta and fibrosisJ World J Gastroenterol，2007，13 ( 22 ) : 3056-3062.4翟華強(qiáng)，楊毅，姜楠益氣活血法對(duì)肺纖維化大鼠膠原動(dòng)態(tài)變化影響J中國(guó)公共衛(wèi)生，2022，24(7):892 893工程的爭(zhēng)辯內(nèi)容、爭(zhēng)辯目標(biāo)，以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題（此局部為重點(diǎn)闡述內(nèi)容）；【爭(zhēng)辯目標(biāo)】說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)百草枯致大鼠肺纖維化中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

23、因子1/Smad3 通路的調(diào)整機(jī)制。補(bǔ)陽(yáng)還五湯改善百草枯致大鼠肺纖維化效果觀看。初步探明補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)百草枯所致肺纖維化的治療作用。【爭(zhēng)辯內(nèi)容】百草枯致肺纖維化過(guò)程中不同階段轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路表達(dá)的爭(zhēng)辯轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1 始終被認(rèn)為纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程中的啟動(dòng)因子，肺纖維化不同階段的表達(dá)差異補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路的調(diào)控機(jī)制爭(zhēng)辯與激素治療組比較，承受 RT-PCR 技術(shù)測(cè)量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路中相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的差異，探討可能的機(jī)制補(bǔ)陽(yáng)還五湯在百草枯致肺纖維化治療方案的爭(zhēng)辯補(bǔ)陽(yáng)還五湯的不同劑量、治療時(shí)機(jī)對(duì)百草枯致肺纖維化的功能改善的爭(zhēng)辯【關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題】補(bǔ)陽(yáng)還

24、五湯通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1/Smad3 通路治療百草枯致肺纖維化確實(shí)立是本課題順當(dāng)進(jìn)展下去的重要前提。這局部工作擬承受病理組織學(xué)及成熟的 RT-PPCR 技術(shù)觀看肺組織病理及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-1)m NA，Smad3mNA 的表達(dá)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯可治療百草枯致肺纖維化是本課題成功的關(guān)鍵。從已有的爭(zhēng)辯看，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可以改善肺纖維化，但對(duì)于百草枯引起的肺纖維化的作用的爭(zhēng)辯尚待確認(rèn)。擬實(shí)行的爭(zhēng)辯方案及可行性分析（包括爭(zhēng)辯方法、技術(shù)路線、試驗(yàn)手段、關(guān)鍵技術(shù)等說(shuō)明）；【爭(zhēng)辯方案】分為預(yù)初試驗(yàn)和正式試驗(yàn)兩個(gè)階段第一階段：預(yù)初試驗(yàn)階段1、體內(nèi)試驗(yàn)動(dòng)物分組：首先：用百草枯造模，依據(jù)補(bǔ)陽(yáng)還五湯給藥劑量的不同將

25、 90 只大鼠隨即分為三組，每組 30 只。三種藥物劑量分別為：kg、kg 和 kg，造模當(dāng)日開(kāi)頭給藥直至處死。然后：每組再依據(jù)觀看持續(xù)時(shí)間的不同分為三個(gè)亞組，每組 10 只。分別觀看至 28、56 和 112 天。觀看指標(biāo)： 1）動(dòng)物存活率動(dòng)物血標(biāo)本：檢測(cè)各組動(dòng)物血常規(guī)、肝、腎功能變化動(dòng)物肺組織病理標(biāo)本：HE 染色，光鏡下觀看組織構(gòu)造、細(xì)胞形態(tài)等變化，以評(píng)價(jià)藥物對(duì)肺組織的影響。2、體外試驗(yàn)：取動(dòng)物肺組織，分別和培育肺泡巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，承受 HE 染色法觀看肺組織肺泡炎程度，RT-PCR 技術(shù)觀看肺組織病理及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF- 1)mRNA，Smad3mRNA 的表達(dá)。觀看不同濃度

26、的補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺組織的影響差異，同時(shí)觀看補(bǔ)陽(yáng)還五湯的體外細(xì)胞毒性作用。3、分析決策：綜合分析體內(nèi)、體外爭(zhēng)辯結(jié)果，選擇動(dòng)物存活率最高，肺組織病理變化最輕， 毒性反響最輕的劑量為最正確給藥劑量。其次階段：正式試驗(yàn)階段1、動(dòng)物分組：首先依據(jù)不同的處理因素，將 1050 只大鼠隨即分為七組，每組 150 只：空白比照組（n=150）：僅用生理鹽水處理PQ 致肺纖維化模型組：依據(jù)文獻(xiàn)方法制作百草枯致肺纖維化動(dòng)物模型補(bǔ)陽(yáng)還五湯處理比照組（n=150）：用預(yù)初試驗(yàn)選定的補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量處理動(dòng)物地塞米松處理比照組（n=150）：用地塞米松處理動(dòng)物PQ+補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療組（n=150）：同百草枯模型組造模。以后用預(yù)

27、初試驗(yàn)選定的補(bǔ)陽(yáng)還五湯劑量處理動(dòng)物PQ+地塞米松治療組（n=150）：同百草枯模型組造模。以后用地塞米松處理動(dòng)物PQ+小劑量 DXM+小劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療組（n=150）：同 PQ 模型組造模。以后用相當(dāng)于第 4）組半量的地塞米松（5mg/kg）和第 3）組半量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯處理動(dòng)物再依據(jù)造模后不同的給藥時(shí)間點(diǎn)，將每組再分為 A、B、C、D、E 五個(gè)亞組，每組五個(gè)亞組，每組30 只：A:當(dāng)日給藥組 B:7 天給藥組 C:14 天給藥組D:28 天給藥組 E:56 天給藥組最終將每個(gè)亞組再依據(jù)給藥后觀看時(shí)間長(zhǎng)短分為 3 組，每組 10 只。2、觀看工程：動(dòng)物存活率肺組織病理標(biāo)本： 1）大體標(biāo)本觀看

28、：各組肺組織的大小、顏色、彈性、膠原形成狀況等2）病理切片觀看：a、HE 染色，光鏡下觀看肺泡炎癥和纖維化程度，特別關(guān)注成纖維細(xì)胞灶形成狀況；b、透射電鏡觀看細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；c、承受 RT-PPCR 技術(shù)觀看肺組織病理及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(TGF-1)mRNA， Smad3mRNA 的表達(dá)。d 、 相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)狀況： 用免疫組化方法檢測(cè)肺組織標(biāo)本中MMP-9/TIMP-1 和 TGF-/INF-的表達(dá)狀況，以反映體內(nèi)致纖維化和抗纖維化細(xì)胞因子的平衡狀況e、肺組織勻漿羥脯氨酸（HYP）含量測(cè)定：反響肺組織纖維化程度3、分析總結(jié)依據(jù)上述爭(zhēng)辯結(jié)果，分析總結(jié)補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否能減輕搏萊霉素致動(dòng)物肺纖維化，

29、以推想將來(lái)能否用于人類百草枯中毒致肺纖維化的治療【技術(shù)路線】【技預(yù)術(shù)關(guān)鍵】除體內(nèi)試驗(yàn)綜合分析體內(nèi)、體外爭(zhēng)辯結(jié)果，選擇動(dòng)物存活率最試驗(yàn)第一局部的技術(shù)關(guān)鍵： 實(shí)高，治療效果最好的劑量組。驗(yàn)體內(nèi)試驗(yàn)：體外試驗(yàn)1、百草枯致肺纖維化動(dòng)物模型的成功建立：國(guó)內(nèi)外已有格外成熟的方法。成功的關(guān)鍵在于給藥方法和藥物在肺內(nèi)的均勻分布。目前常用的方法有氣管插管注入、霧化吸入、氣管穿刺注入和動(dòng)脈灌注等方法。依據(jù)前期試驗(yàn)的閱歷，氣管正插管注入法簡(jiǎn)潔、便利、對(duì)動(dòng)物損傷小，只要操作嫻熟，可確保藥物準(zhǔn)確式對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，得出結(jié)論。到位。注藥后馬上分將組動(dòng)實(shí)物驗(yàn)體位旋轉(zhuǎn)，可使藥物分布均勻。實(shí)驗(yàn)2、本爭(zhēng)辯需要觀看動(dòng)物的存活時(shí)間較長(zhǎng)

30、，對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境要求較高，同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院可以供給符合要求的試驗(yàn)場(chǎng)所3、補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)動(dòng)物重要臟器功能的影響需要進(jìn)展肝、腎功能等檢測(cè)。必需首先用正常大鼠建立正常值范圍。體外試驗(yàn)：肺內(nèi)各種細(xì)胞的培育技術(shù)根本成熟，我院已具備符合要求的細(xì)胞培育條件補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)體外培育細(xì)胞毒性的檢測(cè)方法根本具備其次局部的技術(shù)關(guān)鍵：1、關(guān)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)：主要問(wèn)題是細(xì)胞凋亡推斷標(biāo)準(zhǔn)和定量分析。前述任何一個(gè)指標(biāo)單獨(dú)使用，均不能準(zhǔn)確的反映細(xì)胞凋亡的真實(shí)狀況，將幾種方法結(jié)合運(yùn)用則可相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，較為準(zhǔn)確的定性、定量。因此，本爭(zhēng)辯實(shí)行多種方法聯(lián)合應(yīng)用，從不同角度證明細(xì)胞凋亡大事是否發(fā)生、發(fā)生的時(shí)期和嚴(yán)峻程度。如：（1）檢測(cè)細(xì)胞水平和亞

31、細(xì)胞水平的形態(tài)學(xué)變化：用光鏡可觀看到細(xì)胞變小，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)濃縮并邊緣化，核片段形成和凋亡小體形成；用電鏡可觀看超微構(gòu)造的變化，如胞膜微絨毛變少和消逝等。（2）依據(jù)生化指標(biāo)變化： 如 DNA 片段化的形成，應(yīng)用原位缺口翻譯技術(shù)（TUNEL）進(jìn)展定性和定量檢測(cè)。在定量分析時(shí)，DNA 斷裂點(diǎn)形成是目前最常用的推斷標(biāo)準(zhǔn)，TUNEL 是凋亡檢測(cè)，特別是定量分析中最主要的方法。（3）利用分子生物學(xué)指標(biāo)：主要指凋亡相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。本爭(zhēng)辯選擇多個(gè)促凋亡基因和抗凋亡基因同 時(shí)檢測(cè)，提高準(zhǔn)確性；選擇反映不同凋亡時(shí)期的最新檢測(cè)指標(biāo)，更準(zhǔn)確地幫助 推斷凋亡大事發(fā)生的早晚。（4）利用流式細(xì)胞術(shù)：流式細(xì)

32、胞術(shù)是爭(zhēng)辯程序性細(xì)胞死亡時(shí)細(xì)胞很多特性的一種重要的定性、定量分析技術(shù)。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞 膜的通透性增加，小分子 DNA 片段喪失，用 DNA 特異性熒光染料進(jìn)展染色后， 凋亡細(xì)胞的染色程度下降，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)展DNA 含量的檢測(cè)，可以鑒定出凋亡的細(xì)胞。利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合新的爭(zhēng)辯方法，還可區(qū)分出早期凋亡和晚 期凋亡的細(xì)胞，如進(jìn)展 BALF 中凋亡細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻分析和凋亡細(xì)胞線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)等。技術(shù)關(guān)鍵在于：需保持檢測(cè)標(biāo)本呈單細(xì)胞懸液狀態(tài)，不 至于分散成團(tuán)；活細(xì)胞與死細(xì)胞的鑒別以及早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的鑒別， 都需要不同的檢測(cè)方法和不同的染色劑；在尚未照明細(xì)胞時(shí)觸發(fā)儀器來(lái)進(jìn)展檢 測(cè)以

33、削減本底。2、其他方面的技術(shù)關(guān)鍵問(wèn)題：一方面，本課題組以往的爭(zhēng)辯已經(jīng)積存了較為成熟的閱歷；另一方面，經(jīng)過(guò)預(yù)初試驗(yàn)階段的摸索根本可以解決【可行性分析】1、建立百草枯致肺纖維化動(dòng)物模型的方法已格外成熟, 將 SD 大鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物以及用百草枯制作動(dòng)物肺纖維化模型,目前為國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍承受.本課題組前期爭(zhēng)辯已嫻熟把握了該模型的制作方法.2、補(bǔ)陽(yáng)還五湯延緩肺纖維環(huán)的作用已經(jīng)得到證明, 而且已用于急性粒細(xì)胞白血病的臨床治療, 其有效性和安全性已得到認(rèn)可. 本課題組前期爭(zhēng)辯初步證明其可通過(guò)誘導(dǎo)肺內(nèi)炎性細(xì)胞調(diào)亡而減輕百草枯所致的動(dòng)物肺纖維化 , 為本課題進(jìn)一步爭(zhēng)辯奠定根底.3、主要從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡角度探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯作用機(jī)理 , 聯(lián)合應(yīng)用多種方法從不同角度反映細(xì)胞凋亡大事的發(fā)生、發(fā)生時(shí)間、以及凋亡的程度. 本工程涉及的細(xì)胞凋亡定性和定量分析方法我校均有條件進(jìn)展。4、本課題組曾擔(dān)當(dāng)上海市科委資助課題，為本項(xiàng)爭(zhēng)辯做了大量的前期鋪墊.5、課題負(fù)責(zé)人有著較為豐富的爭(zhēng)辯閱歷和學(xué)問(wèn)積存，在間質(zhì)病爭(zhēng)辯領(lǐng)域有肯定的學(xué)術(shù)地位.6、課題組成員均有較為扎實(shí)的試驗(yàn)爭(zhēng)辯和臨床爭(zhēng)辯根底，以往的