鼠傷寒沙門菌cya基因的克隆表達及生物信息學(xué)分析

1、第 鼠傷寒沙門菌cya基因的克隆表達及生物信息學(xué)分析.06.007開放科學(xué)(資源效勞)標(biāo)識碼(OSID):Cloning，ExpressionandBioinformaticsAnalysisofcyaGenefromSalmonellaTyphimuriumRUPenghui，LUXia，CHENYaohua，LIAOChengshui，YUZuhua，CHENGXiangchao，ZHANGChunjie某(TheKeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicHealth，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang

2、，China)Abstract:TheaimofthisstudywastocloneandbioinformaticsanalyzecyageneofSalmonellaTyphimurium.cyagenewasamplifiedfromtheSalmonellaTyphimuriumSL1344strainbyPCRandthesequencewasclonedintopET-32a(+)vectorforexpressioninEscherichiacoliBL21(DE3)cellsandinducedbyadditionof1mmol/LIPTG.Atthesametime,onl

3、inebioinformaticssoftwarewasusedtoanalyzeitsbioinformatics.TheresultsshowedthatcyagenefromSalmonelaTyphimuriumwas1185bp.SDS-olecularweighZofCyaproteinwas44.97ku，themolecularformularwasC2023H3146N562O578Sn，andtheisoelectric收稿日期：2023-10-27基金工程：河南省自然科學(xué)基金工程(8)作者簡介:茹鵬輝(1998-)，男，河南漏池人，碩士生，研究方向：人獸共患病的診斷和防治

4、,E-mail:penghui_ru163 通信 張春杰(1964-)，女，河南洛陽人，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：動物疫病防控和分子免疫學(xué),E-mail:cjzhangsina 茹鵬輝等：鼠傷寒沙門菌cya基因的克隆表達及生物信息學(xué)分析6期1949point(pI)berofnegativelychargedresidues(Asp+Glu)andpositivelychargedresidues(Arg+Lys)were43and42,respectively.Cyaproteinwasamembraneproteinwithoutsignalpeptideandtransmembr

5、aneregion,containing4N-glycosylationsites,1O-glycosylationsites,27phosphorylationsites,13linearB-cellepitopesand11T-cellepitopes.ThesecondarystructureofCyaproteincontainedalphahelix(38.07%),extendedchain(19.80%),betaturn(5.58%)andrandomcoil(36.55%).Theresultslaidafoundationforfurtherstudyonthefuncti

6、onofCyaproteinofSalmonellaTyphimuriumandtheestablishmentofanimmunoassaymethodusingCyaproteinasantigen.Keywords:SalmonellaTyphimurium；cyagene；prokaryoticexpression；bioinformaticsanalysis鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium)是生物科技；DNA凝膠回收試劑盒購自康寧公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人獸共患食源性致病生命科學(xué)(吳江)；鎳柱親和層析蛋白純化菌,該菌于1884年首次從豬的大腸中別離出來，是試

7、劑盒、TaqPCRMasterMix(2d,bluedye)均購食源性致病菌中比擬常見的一種，臨床病癥主要表自生工生物工程(上海)股份；丙基-硫12+。腺昔酸環(huán)化酶代半乳糖1(IPTG)購自Sigma公司；ECL顯色液(adenylatecyclase,cya)是沙門菌重要的毒力調(diào)節(jié)購自武漢賽維爾生物科技；鼠抗His標(biāo)簽基因之一，可以調(diào)節(jié)沙門菌近50%包括毒力因子在單抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG均購自上海碧云天生物內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄3%在細胞中cya具有催化ATP形技%成的環(huán)腺昔酸(cyclicadenosinemonophosphate,1.3引物設(shè)計及合成某現(xiàn)出傷寒和腸胃炎等病癥cAMP)與其受體

8、蛋白結(jié)合的能力，而cAMP與受體根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的鼠傷寒沙門菌蛋白(CRP)是細菌中存在的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其cya基因序列(登錄號:&1)設(shè)計鼠傷寒沙中cAMP是所有負責(zé)調(diào)控的蛋白中最為重要的，對門菌cya基因所需的特異性引物，cya-F:5，-GAA-轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控到達了一半以上cya基因最A(yù)GCTA-3/(下早被發(fā)現(xiàn)是在阻遏大腸桿菌分解代謝的過程中，參劃線處為BamHI酶切位點)；cya-R:5-CTA-與代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，其突變株可以影響菌毛、鞭毛和代TTCCT-3(下劃謝氨基酸的相關(guān)基因的表達研究說明，敲除線處為Hnd皿酶切位點)%引物由生工生物工程cya基因的鼠其力，有較

9、好的免疫原性，是較為理想的鼠傷寒沙門菌基成%()1.4PCR擴增及克隆因缺失候選疫苗毒株之一89%因此，本試驗克隆分應(yīng)用cya基因特異性引物，利用PCR技術(shù)對鼠析cya基因并實現(xiàn)其體外表達，以期為進一步研究傷寒沙門菌cya基因進行擴增%PCR反響程序:鼠傷寒沙門菌Cya蛋白的功能及建立以Cya蛋白95b預(yù)變性5min；95C變性30s,55C退火30s,為抗原的免疫鑒別檢測方法奠定良好的根底%72C延伸40s,共30個循環(huán)；72C延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌1材料與方法DH5a感受態(tài)細胞，PCR鑒定和提取質(zhì)粒酶

10、切鑒定1.1菌株、質(zhì)粒、及表達載體正確后(命名為pMD19-T-cya),將菌株送至生工生鼠SL1344、pET-32a(+)、大腸桿菌DH5a和)感受態(tài)細胞均由河南科技大學(xué)動物疫病與公共衛(wèi)生重點實驗室保存;物1.5)程(進行測序%pET-32a-cya原核表達載體的構(gòu)建與鑒定建確的pMD19-T-cya進行PMD19-T載體購自寶生物工程(大連)%BamHI和Hnd皿雙酶切后連接至質(zhì)粒pET-1.2主要試劑32a(+)，然后將攜帶有cya基因的原核表達載體限制性內(nèi)切酶BamHI和Hnd皿、T4DNApET-32a-cya轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細連接酶、DNAMarker均購自

11、上海碧云天生物技術(shù)胞中，經(jīng)PCR擴增和雙酶切鑒定，構(gòu)建cya基因原；質(zhì)粒小量提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)pET-32a-cya-BL21%1950中國畜牧獸醫(yī)Cya蛋白的表達、純化及Westernblotting檢測16結(jié)2利用終濃度為1mmol/L的IPTG對重組菌48果cya基因的PCR擴增與克隆2.1pET-32a-cya-BL21進行誘導(dǎo)表達，37C誘導(dǎo)表達鼠傷寒沙門菌NA為模板，應(yīng)用6h后12023r/min離心2min，收集菌體。加適cya基因特異性引物進行PCR擴增，電泳量PBS重懸，冰浴超聲破碎30min后離心，分別收大小約1200bp的目的條帶圖1,與預(yù)期片段大純對小相符%用的

12、樣品進行加組質(zhì)粒pMD19-T-cya進行雙酶切鑒定，結(jié)果出現(xiàn)約入上樣液1/1為4:1,煮沸10min后經(jīng)SDS-2600bp的載體條帶和約1200bp的目的條帶圖PAGE電泳觀察Cya蛋白的表達。電泳在恒壓條2。酶切鑒定正確后的pMD19-T-cya重組質(zhì)粒經(jīng)，用清層析進行純化,的壓為80V,時間約40min；分件下進行，濃縮膠壓為120V，直到樣品到離膠膠底部時%性內(nèi)切酶BamH&、Hnd%對重，cya基因大小測序1185bp，GenBank中SL1344株cya基因相似性為的鼠100%。SDSpET-32a-cya-BL21M電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，PBST洗滌3次，12bp5min/

13、次，5%脫脂奶粉進行封閉過夜，參加1：1000稀釋的抗His標(biāo)簽的抗體37C孵育2h，2023PBST洗滌3次。與1：1000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG結(jié)合23h,PBST洗滌3次，ECL顯色后觀嗪1.7序列相似性比對250查找NCBI中公布的十余種不同物種的Cya氨基酸類似物，利用Mega7.0分析丨Cya的相似性，并構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹%100M,NAMarker；1，ya基因PCR擴增產(chǎn)物；2,陰性對照1.8生物信息學(xué)分析M,NAMarker；1?PCRamplificationresultof利用PrimerPremier5.0軟件將cya基因序列cyagene；2，Neg

14、ativecontrol翻譯成氨基酸序列；利用ExPASy在線網(wǎng)站圖1ProtParam ：$ AProtScale :$/protscale/Biotechhtp：基酸組edu/分別對蛋白分子質(zhì)量性成、蛋白的bp$biotech3ou3性、氨基酸的00碼子和的可溶性進行分析。利用NCBI在線網(wǎng)站 s：$./ASignalP和TMHMMprogramANetNGlyc、NetOGlyc和250NetPhos分別預(yù)測保守區(qū)域、跨膜區(qū)和信號肽、磷酸、N-基O-基；網(wǎng)站 ：$/bcell/； :$ cbs.dtu.dk/services/預(yù)測蛋白可能存在的線性B細胞抗原T細胞用NPSA網(wǎng)htps$npsa-rabbicpifr/cgbin/預(yù)測蛋白的i-；利用SWISS-MODELWorkspace在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白的三級結(jié)構(gòu)%100用在pMD19-T-cya的雙酶切鑒定圖2Fig.2DoubleenzymeidentificationforpMD19-T-cyapET-32a-cya重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定2.2挑取疑似pET-32a-cya重組質(zhì)粒的菌落,提取質(zhì)粒進行PCR和雙酶切BamH&、Hnd%鑒定，泳可6000bp的的目的條帶圖3,與預(yù)期帶1200bp相符，說