海洋生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教案

1、海洋生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教案第1頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四第2頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn) Folin-Wu法定量測(cè)定血糖的含量一、目的要求1、掌握FolinWu法測(cè)定血糖含量的原理和方法。2、學(xué)會(huì)制備無蛋白血濾液。第3頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)原理Cu2+( CuSO4 )+葡萄糖 Cu+(Cu2O) Cu2O +酸性鉬酸試劑 藍(lán)色鉬化合物 OD420比色 無蛋白血濾液中的葡萄糖和堿性硫酸銅溶液共熱反應(yīng)，Cu2+即被葡萄糖還原成Cu+（Cu2O）,Cu2O又把酸性鉬酸試劑（Mo6+）還原成

2、低價(jià)的藍(lán)色鉬化合物鉬藍(lán) 。血濾液中葡萄糖的含量與產(chǎn)生的Cu2O成正比，而Cu2O的量與產(chǎn)生的鉬化合物的量成正比?？捎帽壬ǘ康臏y(cè)定。第4頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、 新鮮兔子血2、 濾紙3、 血糖管（25ml）4、 奧氏吸管（1ml）5、 錐形瓶（50ml）6、 漏斗7、 電爐8、 水浴鍋9、7200型可見分光光度計(jì)第5頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四 1、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.1mg/ml）(1)1%葡萄糖母液：稱取1.000g葡萄糖，溶于蒸餾水，稀釋并定容至100ml。(2)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：取1.0ml葡萄糖母液于1

3、00ml容量瓶中，加蒸餾水定容。2、10%鎢酸鈉溶液：稱取鎢酸鈉10g，溶于蒸餾水并定容至100毫升。3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸餾水中加入1ml的濃硫酸。4、堿性硫酸銅溶液 A液：無水碳酸鈉35g，酒石酸鈉13g及碳酸氫鈉11g溶于蒸餾水，稀釋定容至1000ml. B液：硫酸銅晶體5g，溶于蒸餾水并定容至100ml。 臨用時(shí)，A液：B液=15：1混合（體積比），混合液于冰箱中保存（4）。 四、實(shí)驗(yàn)試劑第6頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四5、酸性鉬酸鹽溶液： 稱取鉬酸鈉600g,用少量蒸餾水溶解后傾入2000ml 的容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖

4、勻，傾入另一較大的試劑瓶中，加溴水0.5ml，搖勻，靜止數(shù)小時(shí)后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，邊加邊搖勻，再加25%硫酸150ml。置暗處次日，用空氣將剩余的溴趕去。然后加99%醋酸75ml，搖勻，用蒸餾水稀釋定容至1000ml,貯于棕色瓶中。 第7頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四1、無蛋白血濾液的制備：用奧氏吸管吸取全血（已加抗凝劑草酸鈉）1ml,緩緩放入50ml錐形瓶中，加蒸餾水7ml，搖勻，溶血后（血液變?yōu)榧t色透明）加10%鎢酸鈉1ml，搖勻。再加0.33mol/LH2SO41ml，邊加邊搖，加畢充分搖勻，防止515

5、分鐘，至沉淀變?yōu)榘底厣ㄈ绮蛔兩稍偌?.33mol/L H2SO412滴）。用干濾紙過濾。先傾入少許，待濾紙濕潤(rùn)后在全部倒入，如濾液不清需重新過濾。每毫升無蛋白血濾液相當(dāng)于1/10ml全血。五、實(shí)驗(yàn)步驟第8頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四1、無蛋白血濾液的制備：吸取全血1ml(奧氏吸管)50ml錐形瓶蒸餾水7ml搖勻溶血（血液變?yōu)榧t色透明）10%鎢酸鈉1ml搖勻0.33mol/LH2SO41ml邊加邊搖放置515分鐘(沉淀變?yōu)榘底厣?干濾紙過濾無蛋白血濾液(每毫升相當(dāng)于1/10ml全血) 取25ml的血糖管(見圖1)3支，編號(hào)。第一支血糖管中加入（空白管）；第二支

6、血糖管中加；用奧氏吸管吸取，放入第三支血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，同時(shí)置于沸水浴中8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后各加4ml酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水稀釋至25ml，混勻，用7220分光光度計(jì)在420波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)。2、血糖的定量測(cè)定：管號(hào)123蒸餾水1ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液1ml無蛋白血濾液1ml第9頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2、血糖的定量測(cè)定： 取25ml的血糖管(見圖1)3支，編號(hào)。第一支血糖管中加入1ml蒸餾水（空白管）；第二支血糖管中加1ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液；用奧氏吸管吸取無蛋白血濾液1ml，放入第三支

7、血糖管中。然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的堿性硫酸銅溶液，同時(shí)置于沸水浴中8分鐘，取出，在流水中迅速冷卻后各加4ml酸性鉬酸鹽溶液。一分鐘后，用蒸餾水稀釋至25ml，混勻，用7220分光光度計(jì)在420波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)。第10頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四第11頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四按下式計(jì)算100ml全血中所含血糖的含量m=OD1/OD2 C 10 100式中:m=100ml全血中含血糖毫克數(shù)C=標(biāo)準(zhǔn)液葡萄糖含量（0.1mg/ml）OD1=樣品液光密度值OD2=標(biāo)準(zhǔn)液光密度值六、結(jié)果計(jì)算：第12頁，共111頁

8、，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn) 肝糖元的提取和鑒定一、實(shí)驗(yàn)原理糖原在濃堿中穩(wěn)定，將肝組織先置于濃堿中加熱，使蛋白質(zhì)及其他成分分解而保留肝糖元。再用濃硫酸使糖原脫水生成糖醛衍生物，衍生物和蒽酮作用形成藍(lán)色化合物，與同法處理的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖一起比色定量。第13頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、 新鮮肝臟2、 100ml容量瓶3、 7220分光光度計(jì)4、 水浴鍋5、 試管(ml、2ml、5ml)第14頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑1、30%NaOH溶液：30gNaOH溶于100ml蒸餾水中2 、標(biāo)準(zhǔn)葡

9、萄糖溶液（0.1mg/ml）：準(zhǔn)確稱取10mg分析純葡萄糖（預(yù)先在110干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定容至100ml.3、顯色劑：稱取0.2g蒽酮加入100ml濃硫酸中。此試劑不穩(wěn)定，以臨用時(shí)配用為宜，冰箱保存可用45天第15頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、準(zhǔn)確稱取肝組織0.5g，放入盛有1.5ml30%NaOH的試管中，置于沸水浴中加熱20分鐘，取出后冷卻，將管中內(nèi)溶物全部轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中（用蒸餾水多次洗滌試管，一并收入容量瓶）加蒸餾水定容。 2、取干燥試管三支，注明空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測(cè)定管，按下表進(jìn)行操作。加畢，搖勻，置沸水浴中10

10、分鐘，冷卻，以空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，在620nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定。 第16頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四五、結(jié)果計(jì)算100g肝組織中所含糖原的克數(shù)=（OD測(cè)/OD標(biāo)）C標(biāo)2100（1/1000） （100/111） （100/0.5）注：100/111是此法測(cè)的葡萄糖含量換算為糖原含量的常數(shù)，即100g糖原用蒽酮試劑顯色相當(dāng)于111g葡萄糖用蒽酮試劑所顯得色第17頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的部分性質(zhì)一、試驗(yàn)原理 蛋白質(zhì)分子中某種或某些基團(tuán)可與顯色劑作用，產(chǎn)生顏色。不同的蛋白質(zhì)由于所含的氨基酸不完全相同，顏色反應(yīng)亦不完全相同。

11、顏色反應(yīng)不是蛋白質(zhì)的專一反應(yīng)，一些非蛋白物質(zhì)也可產(chǎn)生同樣的顏色反應(yīng)，因此不能根據(jù)顏色反應(yīng)的結(jié)果來決定被測(cè)物是否為蛋白質(zhì)。另外，顏色反應(yīng)也可作為一些常用蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。第一部分、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第18頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、吸管 2、滴管 3、試管 4、電爐 5、pH試紙 6、水浴鍋三、實(shí)驗(yàn)試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、 0.5%苯酚：1g苯酚加蒸餾水稀釋至200ml。3、Millons試劑：40g汞溶于60ml濃硝酸（水浴加溫助溶）溶解后，冷卻，加二倍體積的蒸餾水，混勻

12、，取上清夜備用。此試劑可長(zhǎng)期保存。4、尿素晶體5、1%CuSO4：1g CuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸餾水，稀釋至100ml7、濃硝酸8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀釋至100ml.9、 冰醋酸10、濃硫酸第19頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟（一） 米倫（Millons）反應(yīng)原理：米倫試劑是硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物，能與單酚及雙酚和吲哚衍生物起顏色反應(yīng)。單酚（Tyr）與Millon試劑呈粉紅色至暗紅色；雙酚和吲哚衍生物（Trp）與Millon試劑呈黃色至紅色。

13、組成蛋白質(zhì)的氨基酸中含有Tyr和(或)Trp，與Millon試劑反應(yīng)呈顏色反應(yīng)，定性鑒定蛋白的存在。注意：由于尿液中含有的無機(jī)鹽、尿等能造成汞離子的沉淀，因此不能檢測(cè)尿蛋白；同時(shí)也不能檢測(cè)堿性溶液（先酸化）。第20頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四操作1、苯酚實(shí)驗(yàn)取0.5%苯酚溶液1ml于試管中，加Millons試劑0.5ml，于電爐上小心加熱，溶液即出現(xiàn)玫瑰紅色。2、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)取2ml蛋白液，加Millons試劑0.5ml，出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)沉淀，小心加熱，凝固的蛋白質(zhì)出現(xiàn)紅色。第21頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四原理：尿素被加熱，則兩分

14、子的尿素放出一分子氨而形成雙縮脲。雙縮脲在堿性環(huán)境中，能與硫酸銅結(jié)合成紫色的化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。（二） 雙縮脲反應(yīng)第22頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵與縮脲結(jié)構(gòu)相似，故也能進(jìn)行此反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng)可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。注意：但CS-NH2； CH2-NH2； CRH-NH2 ；CH2-NH；-CHNH2 ；CH2OH； CHOH；-CH2NH2等基團(tuán)的存在，甚至過量銨鹽也干擾本實(shí)驗(yàn)。第23頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四操作：1、雙縮脲的反應(yīng)：取少量尿素晶體放在干燥的試管中，微火加熱使其熔化成液體，此時(shí)

15、有氨氣放出，可用濕潤(rùn)的試紙檢驗(yàn)，至液體重新結(jié)晶出現(xiàn)白色固體時(shí)， 停止加熱，冷卻。然后加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。2、蛋白反應(yīng)：取蛋白液1ml，加10%NaOH溶液1ml，搖勻，再加2-4滴1% CuSO4溶液，混勻，觀察有無紫色出現(xiàn)。第24頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四原理：蛋白質(zhì)分子中芳香族氨基酸，特別是Tyr、Trp側(cè)鏈基團(tuán)與濃硝酸反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，此物質(zhì)在堿性環(huán)境下變?yōu)榻埸S色的鄰硝醌酸衍生物。Phe在少量濃硫酸和濃硝酸條件下反應(yīng)亦生成黃色物質(zhì)。操作：取一支試管，加入1ml蛋白液及濃硝酸5滴。加熱

16、，冷卻后注意顏色變化。然后再加入10%NaOH溶液1ml，顏色有什么變化？（三） 黃色反應(yīng)第25頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四原理：蛋白質(zhì)與茚三酮共熱，產(chǎn)生蘭紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應(yīng)為一切蛋白質(zhì)及a-氨基酸所共有。亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）與茚三酮反應(yīng)呈黃色，含有氨基的其他物質(zhì)（氨、-Ala和許多一級(jí)胺）亦呈此反應(yīng)。反應(yīng)靈敏度達(dá)1:1500000(pH5-7)，廣泛用于氨基酸定量測(cè)定。（四） 茚三酮反應(yīng)第26頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四操作：取蛋白液1ml于試管中，加4-8滴茚三酮溶液，加熱至沸，即有藍(lán)紫色出現(xiàn)

17、。反應(yīng)溶液的pH，直接影響實(shí)驗(yàn)成敗第27頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四第二部分、蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)一、試驗(yàn)原理在水溶液中蛋白質(zhì)分子的表面由于形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒。在一定的物理或化學(xué)因素的影響下，破壞其表面的水層、電層，甚至變性，將以固態(tài)形式從溶液析出，該過程為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)?？赡娴某恋矸磻?yīng)：分子結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，去除沉淀因素后可溶解。低溫下乙醇、丙酮、中性鹽硫酸胺等。不可逆的沉淀反應(yīng)：內(nèi)部結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象遭到破壞，失去天然特性，不能恢復(fù)溶解狀態(tài)。重金屬、生物堿試劑、過酸堿、加熱、超聲波、有機(jī)溶劑等。第28頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)

18、42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、移液管 2、吸管 3、試管 4、電爐三、實(shí)驗(yàn)試劑1、卵清蛋白液：雞蛋清用蒸餾水稀釋10-20倍，3-4層紗布過濾，濾液放在冰箱里冷藏備用。2、飽和硫酸銨溶液：100ml蒸餾水中加硫酸銨至飽和。3、硫酸銨晶體：用研缽研成碎末。4、95%乙醇。5、醋酸鉛溶液：1g醋酸鉛溶于蒸餾水并稀釋至100ml。6、硫酸銅溶液：1g CuSO4晶體溶于蒸餾水，稀釋至100ml。7、氯化鈉晶體。8、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸餾水中并稀釋至100ml。9、飽和苦味酸溶液：100ml蒸餾水中加苦味酸至飽和。10、1%醋酸溶液。第29頁，共111頁，2022年，5月20日，1

19、2點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）蛋白質(zhì)的鹽析作用原理：向蛋白質(zhì)中加入大量的中性鹽（硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等），使蛋白質(zhì)膠體顆粒脫水，破壞其水化層，同時(shí)它所帶有的電荷亦被中性鹽上所帶的相反電荷的離子所中和。于是穩(wěn)定因素被破壞，蛋白質(zhì)聚集沉淀。鹽析作用一般不使蛋白質(zhì)變性。 操作1、取試管1支，加蛋白液2ml，在加入飽和硫酸銨溶液2-4ml，搖勻靜置數(shù)分鐘，則有球蛋白析出。2、將上述混合液過濾。向?yàn)V液中逐漸加入少量固體硫酸銨（每次加入量約為米粒大?。?，邊加邊搖，直至飽和為止，此時(shí)析出為清蛋白。再加入少量蒸餾水，觀察沉淀是否溶解。第30頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四（

20、二）有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)原理：某些有機(jī)溶劑（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白質(zhì)脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點(diǎn)間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝聚而沉淀。操作：取一試管加蛋白液1ml，加入晶體氯化鈉少許，待溶解后再加95%乙醇3ml,搖勻，觀察現(xiàn)象。第31頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四（三）重金屬鹽與某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)原理：重金屬離子（如Pb2+、Cu2+等）與蛋白質(zhì)的羧基等結(jié)合生成不溶性的金屬鹽類而沉淀，同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生變性。某些有機(jī)酸的酸根則與蛋白質(zhì)的自由氨基結(jié)合而沉淀。 操作：取試管2支，各加蛋白液2ml，一支管中滴加1%醋酸鉛溶液，另一支管中滴加1

21、%硫酸銅溶液，至有沉淀產(chǎn)生。第32頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四（四）生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)原理：植物體內(nèi)具有顯著生理作用的含氮堿性化合物成為生物堿。能沉淀生物堿或與其產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)稱為生物堿試劑。當(dāng)溶液PH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶正電荷，容易與生物堿試劑的負(fù)離子發(fā)生反應(yīng)而沉淀。操作：1、取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加5%鞣酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。2、取一支試管，加入蛋白液2ml及醋酸4-5滴，再加飽和苦味酸數(shù)滴，觀察現(xiàn)象。第33頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)五 雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度一、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)在堿性溶液

22、中可與CU2+形成紫色化合物，在一定濃度的范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與生成的紫色化合物顏色的深淺成正比，可用比色法測(cè)定。第34頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、 試管2、 吸管3、容量瓶4、7220分光光度計(jì)第35頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑1、1mg/ml卵清蛋白液：將1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀釋至1000ml.2、雙縮脲試劑：將1.75gCuSO4.5H2O溶于約150ml蒸餾水，然后置于1000ml容量瓶中，加入300ml濃氨水、300ml冰冷的蒸餾水和200ml飽和氫氧化鈉溶液，搖勻，室溫放置2

23、小時(shí)，再加蒸餾水至刻度，搖勻備用。第36頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取7支干燥的試管，按下表加入試劑：將上述溶液混合后，試管中即有紫紅色出現(xiàn)，在540nm下測(cè)的各管的吸光度，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、 樣液的測(cè)定取未知濃度的蛋白質(zhì)溶液3.0ml置試管中，加入雙縮脲試劑2.0ml，混勻，測(cè)其540nm的吸光度，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得未知液蛋白質(zhì)濃度。第37頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)六 氨基酸得紙層析法一、原理 以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水

24、和有機(jī)溶劑組成。展層時(shí)，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強(qiáng)；有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，它與濾紙纖維親和力弱。有機(jī)溶劑在濾紙上又下向上移動(dòng)的，稱為上行法；有上向下移動(dòng)的，稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點(diǎn)處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進(jìn)行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。 在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動(dòng)速率（Rf值）Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離 用混合氨基酸做樣品時(shí)，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動(dòng)速率

25、相同或相近，就不能將它們分開，為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點(diǎn)為原點(diǎn)，在用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試?yàn)主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有谷氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。第38頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器 1、新華濾紙 2、層析缸 3、細(xì)線 4、點(diǎn)樣管 5、橡皮筋 6、電吹風(fēng) 7、噴霧器第39頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑1、混合氨基酸 2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、0.5%茚三酮無水丙酮

26、溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶中 第40頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、試驗(yàn)步驟 1、取濾紙條一張，在一端打孔，系一根細(xì)線，在另一端3cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點(diǎn)（原點(diǎn)）。 2、取毛細(xì)管一支，吸取氨基酸混合液，在原點(diǎn)處點(diǎn)樣，樣點(diǎn)直徑不宜超過5mm,每點(diǎn)一次用吹風(fēng)機(jī)吹干，點(diǎn)23次為佳。 3、點(diǎn)樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點(diǎn)樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，展層23小時(shí)。 4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風(fēng)吹干（或烘箱60）烘干。 5、均勻噴上0.5茚三酮無水丙酮液，注意使溶液不到流，不間斷。 6、用吹風(fēng)機(jī)烘干，

27、觀察層析點(diǎn)，確定其幾何中心。 7、量取數(shù)值，計(jì)算各自的Rf值，與表中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。第41頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)七 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白一、原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當(dāng)PHPI時(shí)，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)；當(dāng)PHPI時(shí)，蛋白質(zhì)為正離子，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，在同一PH值時(shí)，因所帶電荷不同，而在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度也不相同，故可用電泳法將其分離。 本試驗(yàn)以牛血清為材料，醋酸纖維薄膜為支持物，通過點(diǎn)樣、電泳、染色、脫色從而得到血清中蛋白質(zhì)的分離圖譜，再進(jìn)行觀察和定量分析。第42頁，共111頁，

28、2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器1、 牛血清2、 醋酸纖維薄膜3、 鑷子4、 電泳儀5、 電泳槽6、 載玻片第43頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑 1、巴比妥巴比妥鈉緩沖液（離子強(qiáng)度，PH8.6）：稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。用pH計(jì)較正后使用。 2、染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸餾水40ml混勻即可。 3、漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml混勻即可。第44頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、試驗(yàn)步驟

29、1、準(zhǔn)備：用鑷子取薄膜一條，浸入緩沖液中，完全浸透后（大約3-5分鐘），用鑷子取出，將無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，將濾紙對(duì)折，吸取多余的緩沖液。 2、點(diǎn)樣：取載玻片一塊，用點(diǎn)樣管將血清均勻的涂在載玻片的一端面上，在薄膜一端1/3處點(diǎn)樣。 3、電泳：將薄膜平貼于放在電泳槽上并已浸透緩沖液的濾紙上，無光澤面要向下放置，點(diǎn)樣端放在陰極，進(jìn)行電泳。電泳條件：電壓90-110V，電流0.4-0.6A,通電60分鐘。 4、染色：電泳完畢，將薄膜浸入染色液中5-10分鐘，進(jìn)行染色。 5、漂洗：染色完畢，將薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景無色，在浸入蒸餾水中。 6、圖譜觀察：觀察圖譜，將各種血清蛋白質(zhì)

30、按實(shí)際比例大小繪于實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上。第45頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四一、原理聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳是根據(jù)被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子的大小，形狀的不同，在電場(chǎng)的作用下，產(chǎn)生不同的速度而分離的方法。它具有分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)、濃縮效應(yīng)三重作用。在這三重效應(yīng)的共同作用下使血清蛋白中不同的蛋白質(zhì)分離開來。實(shí)驗(yàn)八 聚丙烯酰胺凝膠盤狀電泳法分離牛血清蛋白 第46頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀電泳槽注射器長(zhǎng)針頭吸管培養(yǎng)皿第47頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑三羥甲基氨基甲烷（簡(jiǎn)稱Tri

31、s）貯備液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各貯備液，然后冷藏于4條件下，以防變質(zhì)。染色液： 0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用靈敏度高5倍考馬斯亮藍(lán)R250溶液染色。脫色液：7%醋酸溶液。電極緩沖液（pH8.3甘氨酸-Tris緩沖液）：甘氨酸28.8g，Tris0.6g加水定容至1000ml.示蹤劑：0.01%溴酚藍(lán)溶液。第48頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟1.制膠：取一支長(zhǎng)10cm左右的玻璃管，在一端套上乳膠管和短玻棒。1）7%聚丙烯酰胺凝膠（PH8.9，分離膠）：將試劑按A:C:H2O:E=1：2：1：4比例混合于一燒杯中，用滴

32、管將分離膠加入玻璃管至8cm高度，表面再加少量水覆蓋，在日光燈下聚合20分鐘左右，當(dāng)有界面出現(xiàn)時(shí)，表明已經(jīng)聚合，吸取分離膠表面的水分。第49頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2）2.5%聚丙烯酰胺凝膠（pH6.7，分離膠）：將試劑按B:D:F:E=1：2：1：4比例混合于燒杯中，迅速將其用滴管加到分離膠上面。至玻璃管9厘米處（即加入1厘米高），在小心地加入一層薄水。然后膠管移至日光燈下放置20分鐘左右，待第二次出現(xiàn)界面，表示聚合完成，除去表面水分。第50頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四序號(hào)ABCDEF1mol/L鹽酸TrisTEMEDACr

33、Bis(NH4)2S2O3蔗糖加水并稀釋至PH48ml36.6g0.23ml100ml8.948ml5.98g0.46ml100ml6.728g0.735g100ml10g2.5g100ml0.14g100ml40g100ml第51頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2.安裝膠管把玻璃管下端得橡皮冒除去（拔時(shí)用力不要過猛，以防使膠條受損），將膠管安裝在電泳儀上。注意垂直，并要緊密，防止緩沖液從上槽漏下。先向各膠管中加滿電極緩沖液，不要有氣泡留存，在向下槽注入緩沖液，然后將膠管下降至下槽緩沖液內(nèi)。3.加樣1ml新鮮血清。用40%蔗糖溶液稀釋10倍，加1ml0.1%溴酚藍(lán)示

34、蹤劑混勻。用微量注射器或移液槍向膠管內(nèi)加5-10ul樣品液，注意微量注射器或移液槍頭要插入膠管內(nèi)加液。第52頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四4.電泳上槽連接負(fù)極，下槽連接正極，然后通電，先每管電流3mA電泳，當(dāng)示蹤劑進(jìn)入分離膠時(shí)，電流增至每管5mA。當(dāng)示蹤劑移至膠管下端1cm處時(shí)，關(guān)閉電源，取出膠管。電泳大約2-3小時(shí)。5.剝膠取一只帶長(zhǎng)針頭的注射器，灌滿水，將針頭從濃縮膠的一端小心的管壁與凝膠之間，轉(zhuǎn)動(dòng)膠管，并同時(shí)推動(dòng)注射器，在針頭向前推動(dòng)時(shí)，注入蒸餾水，使膠條隨水的壓力及潤(rùn)滑作用從玻璃管中脫離。第53頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四6

35、.染色將剝出的膠條于氨基黑10染色液或染色靈敏度高倍的考馬斯亮藍(lán)溶液中染色10分鐘7.脫色將膠條自染色液中取出后，用水沖去表面的染料，置于7%醋酸溶液中浸洗脫色，經(jīng)常換新溶液，直至背景幾乎無色為止，約需2-3天的時(shí)間8.觀察繪圖將脫色膠條取出放于濾紙上，觀察分離色帶，將結(jié)果繪于實(shí)驗(yàn)報(bào)告紙上。第54頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)九 胰蛋白酶活力測(cè)定 一、原理福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍(lán)色化合物（鎢藍(lán)和鉬藍(lán)）。蛋白質(zhì)中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林酚試劑反

36、應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在一定的范圍內(nèi)，藍(lán)色化合物顏色的深淺與酶活力的大小成正比。第55頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器試管7220分光光度計(jì)恒溫水浴鍋第56頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑福林試劑B：見福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度部分0.55mol/L碳酸鈉溶液：58.3g無水碳酸鈉溶于蒸餾水，稀釋并定容至1000ml010%三氯乙酸溶液0. 2mol/L磷酸緩沖液：0.5% 酪素溶液：稱取0.5g酪素，以0.5mol/L氫氧化鈉1ml濕潤(rùn)，再加少量0. 2mol/L磷酸緩沖液稀釋。在水浴中煮沸溶解，

37、冷卻，稀釋并容至100ml，冷藏在冰箱里。第57頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2mol/L鹽酸溶解，定容至100ml，分別配成0-100ug/ml不同濃度溶液，不同濃度各取酪氨酸液1ml，加0.5%酪素2ml，于37水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入10%三氯乙酸3ml，離心或過濾除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸鈉5ml，再加入福林試劑1ml，于37 水浴中顯色15分鐘，測(cè)OD680。以光密度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。第58頁，共111頁，2022年，5月20日，1

38、2點(diǎn)42分，星期四樣品測(cè)定：取干燥的試管2支，按下表加入試劑管號(hào)12備注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中顯色15分鐘0. 2mol/L磷酸緩沖液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0過濾上清液1137水浴中顯色15分鐘0.55mol/L碳酸鈉溶液5.05.0福林試劑B11OD6800第59頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四五、結(jié)果計(jì)算酶活力：在37下每分鐘水解酪素產(chǎn)生lug酪氨酸為一個(gè)活力單位。樣品中含酶活力單位=A/15 FA樣品測(cè)定光密度查曲線得相當(dāng)酪氨酸ug數(shù)F酶液稀釋倍數(shù)第60頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42

39、分，星期四實(shí)驗(yàn)十、酵母RNA的提取及鑒定 一、原理酵母核酸中RNA含量較多，DNA含量則少于2%。RNA可溶于堿性溶液，當(dāng)堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。第61頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī)水浴鍋電爐燒杯量筒第62頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑干酵母粉0.2%氫氧化鈉溶液：2g氫氧化鈉溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。乙酸95%乙醇無水乙醚10%硫酸氨水5%硝酸銀溶液：5g硝酸銀溶于蒸餾水并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中。苔黑酚-三氯化鐵溶液：將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再

40、加入100mgFeCl3.6H2O。臨用時(shí)配制。第63頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟1.RNA的提?。悍Q取4g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%氫氧化鈉溶液40ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。然后加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10-15分鐘（）。取上清液，加入95%乙醇30ml，邊加邊攪，加畢，靜止，待完全沉淀，過濾。濾渣先用95%乙醇洗2次，每次約10毫升，再用無水乙醚西2次，每次也約10ml。洗滌時(shí)可小心地用玻璃棒攪動(dòng)沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可鑒定。第64頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星

41、期四2.鑒定：取上述RNA約0.5g，加10%硫酸5ml,加熱至沸12分鐘，將RNA水解。取水解液0.5ml，加入苔黑酚-三氯化鐵溶液1ml，加熱至沸1分鐘，觀察顏色變 化。水解液2ml，加入氨水2ml和5%硝酸銀溶液1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物。第65頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)十一 DNA的定量測(cè)定-二苯胺法 一、原理DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中變成-羥基-a-酮基戊糖，與二苯胺試劑作用生成藍(lán)色化合物，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)，化合物藍(lán)色的深淺與DNA的含量成比例關(guān)系，可用比色法測(cè)定。第66頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，

42、星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器試管移液管7220分光光度計(jì)第67頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑1、DNA標(biāo)準(zhǔn)液（100ug/ml）：稱取10mgDNA鈉鹽溶于5mol/l氫氧化鈉溶液并稀釋至100ml。2、二苯胺試劑：A液：稱取純二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加濃硫酸1.5ml。貯于棕色瓶中。B液：稱取1.6ml乙醛溶于100ml蒸餾水中，臨用時(shí)配制臨用時(shí)，將20mlA液和0.1mlB液混合即可第68頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、試驗(yàn)步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取干燥的試管6支，編號(hào)，按下表加入試劑：012345DNA標(biāo)準(zhǔn)液

43、00.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.80.60.40.20二苯胺試劑2.02.02.02.02.02.0加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，以吸光度對(duì)DNA濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。第69頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2.樣品測(cè)定吸取DNA樣液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml, 加畢，混勻，在60度水浴中保溫45分鐘，冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，根據(jù)所測(cè)得的吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得DNA的質(zhì)量。五、結(jié)果計(jì)算按下式計(jì)算樣品中DNA百分含量：DNA%=樣液中測(cè)的DNA量/樣液中所含樣品量*100%第70頁，共111頁，2

44、022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)十二 維生素C的定量測(cè)定（2，6-二氯靛酚滴定法） 一、原理維生素c又稱為抗壞血酸，其還原型能還原染料2，6-二氯靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸。在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成紅色，被還原后變?yōu)闊o色。因此可用2，6-二氯靛酚滴定樣品中含有的維生素C，當(dāng)樣品中的維生素C被完全還原后，在滴加過量的2，6-二氯靛酚，溶液變?yōu)榈t色，即為終點(diǎn)。如無其他雜質(zhì)干擾，則樣品液所還原的2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含有維生素C的量成正比。第71頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二、實(shí)驗(yàn)儀器新鮮水果吸管容量瓶滴定裝置錐形瓶研缽漏斗第7

45、2頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三、實(shí)驗(yàn)試劑1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸餾水。2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸餾水。3、標(biāo)準(zhǔn)維生素C液：準(zhǔn)確稱取10.0mg維生素C，溶于1%草酸溶液，并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中，冷藏，最好臨用時(shí)配制。此溶液濃度0.1mg/ml.4、0.1%2，6-二氯靛酚溶液：稱取500mg2，6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻，加蒸餾水并稀釋至500ml，濾去不溶物，貯于棕色瓶中，冷藏。第73頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四四、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品中抗壞血酸的

46、提?。簩⑺盟锤蓛簦脼V紙吸取表面水分。稱取2.0g，加2%草酸試劑100ml置組織搗碎機(jī)中打成漿狀。稱取漿狀物5.0g，倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀釋并定容，混勻，靜止10分鐘，過濾（最初數(shù)毫升濾液棄去），濾液備用。第74頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2.滴定1) 標(biāo)準(zhǔn)液的滴定：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1.0ml于100ml錐形瓶中，加9ml1%草酸溶液，用2，6-二氯靛酚滴定至淡紅色。滴定終點(diǎn)要保持15秒鐘。有所用2，6-二氯靛酚的體積算出1ml染料相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸。2) 樣品液的滴定：準(zhǔn)確吸取濾液兩份，每份10ml，分別放入兩個(gè)100ml

47、錐形瓶中，滴定方法同上。第75頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四五、結(jié)果計(jì)算按下式計(jì)算100mg樣品中含抗壞血酸的毫克數(shù)：m=V*T/W*100V=滴定時(shí)所用染料ml數(shù)T=每毫升染料氧化抗壞血酸質(zhì)量W=10ml樣液相當(dāng)于含樣品的質(zhì)量數(shù)第76頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四綜合實(shí)驗(yàn)一 葡糖1磷酸的制備及其純度測(cè)定 第77頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四在酸性條件下用2倍體積乙醇沉淀無機(jī)磷酸鹽等雜質(zhì)，然后在堿性條件下(pH8.4)，得G-1-P鉀鹽沉淀。精制后通過測(cè)定有機(jī)磷含量來計(jì)算純度。 淀粉在磷酸鹽存在下經(jīng)過磷酸

48、化酶的作用，分解生成磷酸己糖，其第一個(gè)產(chǎn)物為葡糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate,簡(jiǎn)稱G-1-P）。保溫后，將混合物加熱煮沸，使蛋白質(zhì)變性，破壞磷酸化酶以終止酶促反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)原理第78頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四1）馬鈴薯4預(yù)冷 24小時(shí)2）將100ml蒸餾水、兩個(gè)500ml燒杯放入冰浴中冷卻3）將馬鈴薯削皮，切成1cm見方的小塊，放入冰浴中一燒杯內(nèi)，滿一燒杯為止。4）于絞肉機(jī)中攪碎，倒入燒杯內(nèi)冰浴中冷卻。5）向燒杯內(nèi)加50ml蒸餾水，攪拌15min（不要太劇烈）6）將漿液用紗布過濾，濾液擠入冰浴中另一燒杯內(nèi)，放置待用。 1、磷酸化酶的制備濾液馬

49、鈴薯組織勻漿器紗布過濾第79頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四2、淀粉磷酸鹽溶液的制備1）稱取6g磷酸二氫鉀、7.78g磷酸氫二鉀，加70ml蒸餾水，煮沸。2）稱取4g可溶性淀粉，加10ml蒸餾水，攪拌。3）劇烈攪拌下，將淀粉呈細(xì)流狀加到上述磷酸鹽溶液中。4）繼續(xù)加熱5min。此時(shí)溶液為米黃色透明，冰浴中冷卻。6g磷酸二氫鉀、7.78g磷酸氫二鉀70ml蒸餾水4g可溶性淀粉10ml蒸餾水第80頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四3、保溫酶液淀粉磷酸鹽溶液1）酶液將與淀粉磷酸鹽溶液混合，棄去泡沫，2）加少量甲苯，在溶液表面成一薄層。甲苯3）于33

50、保溫24h4）將保溫液表層泡沫污物棄去，用碘碘化鉀試劑進(jìn)行碘反應(yīng)檢驗(yàn)，不顯藍(lán)色則進(jìn)行以下操作。 33保溫24h第81頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四4、處理保溫液1）采用分批煮沸的方法，使每次煮沸厚度為1cm左右將保溫液煮沸。要在1min內(nèi)完全沸騰，繼續(xù)加熱3min2）冰浴中快速冷卻，1min內(nèi)冷卻至室溫。3）將上清液用布氏漏斗抽濾，沉淀3000r/min離心5min后，再將上清過濾3000r/min離心5min冰浴第82頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四4）濾液加2倍體積95乙醇，迅速攪拌，磷酸調(diào)pH至4.2（在冰浴中操作）。此時(shí)有白色磷

51、酸鹽沉淀。5）半小時(shí)后，在布氏漏斗上通過兩層濾紙抽濾。6）將濾液在低溫下用飽和KOH溶液調(diào)pH至8.4，可得葡糖1磷酸二鉀鹽沉淀。靜置24個(gè)小時(shí)濾液2倍體積95乙醇磷酸調(diào)pH至4.2飽和KOH溶液調(diào)pH至8.4靜置24個(gè)小時(shí)7)過濾，即為粗產(chǎn)品第83頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四飽和KOH溶液調(diào)pH至8.4靜置5、產(chǎn)品的精制1）將抽干的粗產(chǎn)品用少量蒸餾水溶解，再加鎂銨溶液10ml左右，至沉淀不再溶解。抽濾去除沉淀（主要為磷酸銨鎂）。粗產(chǎn)品蒸餾水溶解鎂銨溶液10ml2）向清液中加入2倍體積95乙醇，用10mol/L鹽酸調(diào)pH至4，濾去沉淀（無機(jī)磷酸鹽）。濾液2倍體積

52、95乙醇10mol/L鹽酸調(diào)pH至4.23）清液用飽和氫氧化鉀溶液調(diào)至pH值8.4，靜置4）抽濾即得精產(chǎn)品，純度不低于70。干燥第84頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四6、定磷曲線的制定準(zhǔn)確吸取磷標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL(相當(dāng)于含磷量0、5、10、20、30、40、50g),分別置于20mL具塞試管中。各管用蒸餾水補(bǔ)足到5ml，分別加3ml定磷試劑，45恒溫水浴保溫25min。在分光光度計(jì)660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以測(cè)出的吸光度對(duì)磷含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。磷標(biāo)準(zhǔn)（mL）00.51.02.03.04.05.0蒸餾水54.54.03.0

53、2.01.00定磷試劑3ml3ml3ml3ml3ml3ml3ml45恒溫水浴25min25min25min25min25min25min25min660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度第85頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四7、葡糖1磷酸純度檢測(cè)1) 稱取7.44mg1G1P產(chǎn)品，溶于水，定容至10ml。2)取2只試管，各加0.2ml（有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定）產(chǎn)品溶液。3) 管1加1ml2mol/L鹽酸，100加熱水解10min（有機(jī)磷全部溶解）。取出冷卻，加12滴酚酞試劑，KOH調(diào)pH至紅色4) 管2以水代替鹽酸，不加熱。5)另取一空白管3，不加樣品管1管2管3鹽酸水不加樣品樣品樣

54、品樣品水100加熱水解10min第86頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四三管中溶液體積用水補(bǔ)足到5 ml。加3ml定磷試劑，45恒溫水浴保溫25min。660nm波長(zhǎng)測(cè)光吸收。從定磷標(biāo)準(zhǔn)上查出樣品管及對(duì)照管的磷量，然后計(jì)算產(chǎn)品的含量百分?jǐn)?shù)。產(chǎn)品含量（樣品管磷量對(duì)照管磷量）稀釋倍數(shù)/0.06607100 第87頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四綜合實(shí)驗(yàn)二 動(dòng)物肝臟中DNA的提取與含量測(cè)定 第88頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四在制備核酸時(shí)應(yīng)防止過酸、過堿及其它能引起核酸降解的因素的作用。全部操作過程應(yīng)在低溫下（4）進(jìn)

55、行，必要時(shí)還要加入酶抑制劑。如檸檬酸、氰化物、砷酸鹽、乙二胺四乙酸（EDTA）等可以抑制DNA酶活性，SDS或苯酚等蛋白變性劑也可使核酸降解酶破壞。一、目的學(xué)習(xí)和掌握用濃鹽法從動(dòng)物組織中提取DNA的原理和技術(shù)二、原理核酸和蛋白質(zhì)在生物體中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于細(xì)胞核中，RNA主要存在于核仁及胞質(zhì)中第89頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四DNA核蛋白能溶于水及高濃度的鹽溶液（如1mol/L NaCl）在0.14mol/L 的鹽溶液中溶解度降低而RNA核蛋白則溶于0.14mol/L 鹽溶液，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖蛋白和核糖蛋白從樣品中分別

56、抽提出來脫氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸鈉）處理，DNA即與蛋白質(zhì)分開可用氯仿異戊醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA則溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纖維狀沉淀出來。第90頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四1、稱取肝臟8g，在冰浴中用研缽磨碎。2、加約20ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液，3、4000r/min離心10min。4、沉淀再研磨一下，加25ml緩沖液，4000r/min離心20min。第91頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四5、取沉淀，加入40ml 0.1mol/L NaCl-

57、0.05mol/L檸檬酸鈉緩沖液、20ml CHCl3-異戊醇混合液、 4ml 5 SDS使其終濃度為0.41，冰浴中，在搖床上振搖30min。40ml 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 檸檬酸鈉緩沖液20ml CHCl3-異戊醇混合液4ml 5 SDS搖床上振搖30min第92頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四6、向溶液中緩慢加固體NaCl，使其終濃度為1mol/L（約3.6g）。將混合液在3500r/min離心20min。 7、取上清，加入等體積冷95乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢攪動(dòng)，將纏繞在玻璃棒上的凝膠狀物用濾紙吸取多余乙醇，即得DNA粗品。 NaC

58、l （約3.6g）3500r/min離心20min。取上清，加入等體積冷95乙醇第93頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四8、提純將上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl0.0015mol/L 檸檬酸三鈉溶液中9、加入1倍體積的氯仿異戊醇混合液，振搖10min，離心（4000r/min，10min）。.0.015mol/L NaCl0.0015 mol/L 檸檬酸三鈉溶液氯仿異戊醇混合液4000r/min，10minDNA粗品第94頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四10、傾出上層液（沉淀?xiàng)壢ィ尤?.5 倍體積95乙

59、醇，DNA即沉淀析出。11、離心，棄去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步驟重復(fù)一次。最后所得沉淀用無水乙醇洗滌2次，真空干燥。95乙醇4000r/min，10min棄上清傾出上層液（沉淀?xiàng)壢ィ┐諨NA第95頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四012345樣品標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液g/ml0.00.40.81.21.62.01蒸餾水/ml2.01.61.20.80.401二苯胺試劑/ml4.04.04.04.04.04.04.0A595nm1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按下表加入各種試劑，混勻，于60恒溫水浴保溫45min2、冷卻后，在595nm波長(zhǎng)下，于722型分光光度計(jì)上比色測(cè)定，以吸

60、廣度對(duì)DNA濃度作圖，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNA含量的測(cè)定第96頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四3、計(jì)算100g豬肝中DNA含量：m1/m2100式中：DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）；m1：樣液中測(cè)得的DNA的質(zhì)量（g）；m2：樣液中所含樣品的質(zhì)量（g）。第97頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四實(shí)驗(yàn)十 酶的專一性研究 一、原理用不同的醇作底物，觀察醇脫氫酶的專一性。根據(jù)NADH對(duì)340nm波長(zhǎng)紫外線有最大吸收的特性，可用OD340nm表示酶活力。每毫克酶蛋白有多少酶活力單位成為酶的比活力。第98頁，共111頁，2022年，5月20日，12點(diǎn)42分，星期四二