分子標記技術20091課件

1、分子標記技術Molecular Marker Technology 分子標記技術課程安排一、分子標記技術概述 (3)二、DNA的提取、PCR優(yōu)化與克隆 (3)三、顯性分子標記技術 (ISSR、AFLP) (6)四、共顯性分子標記技術(RFLP、SSR) (6)五、分子標記數(shù)據(jù)的讀取方法與分析 (3)六、序列測定與分析 (3)文獻討論 (6-12) 周延清(編著). 2005. DNA分子標記技術在植物研究中的應用. 北京：化學工業(yè)出版社 鄭成木主編. 2003. 植物分子標記原理與方法. 長沙：湖南科學技術出版社 鄒喻蘋,葛頌,王曉東等.2001.系統(tǒng)與進化植物學中的分子標記.北京:科學出版社

2、 Caetano-Anolles G & Gresshoff P M (eds) . 1998. DNA Markers: Protocols, Applications, and Overviews. New York: Wiley-Vch Press. 王中仁. 1996. 植物等位酶分析. 北京：科學出版社參 考 資 料一、分子標記技術概述形態(tài)標記Color: yellow vs white etcTexture: smooth vs rough etcShape: round vs irregular etc 遺傳標記原用于遺傳作圖，確定染色體上基因順序（gene mapping） 1

3、913年，Alfred H. Sturtevant 使用六個形態(tài)標記構建了第一個果蠅遺傳圖譜 1923年，Karl Sex發(fā)現(xiàn)菜豆數(shù)量性狀（種子顏色和大?。┖蛿?shù)量性狀位點之間的遺傳連鎖 （QTL）細胞學標記核型分析 (karyotype analysis)染色體顯帶 (chromosome banding) 分子標記 或蛋白質(zhì)序列（大?。?狹義的) 指基于DNA分子序列的標記(廣義的) 指可遺傳的、且可檢測到的DNA序列是以生物大分子的多態(tài)性為基礎的一種遺傳標記 分子標記是能反映生物個體或種群間基因組中某些差異特征的DNA片段 分子標記（molecular marker）技術產(chǎn)生的原因：（形態(tài)

4、性狀的局限） 基于形態(tài)的遺傳標記（形態(tài)標記）發(fā)展到同工酶又到DNA分子標記 DNA分子標記在分子生物學的發(fā)展過程中誕生和發(fā)展，它能夠直接反映基因組DNA間的差異* DNA或cDNA等分子水平上的多態(tài)性檢測技術* 能提供分子標記的分子生物學技術分子標記技術First Generation: 1980s -Based on DNA-DNA hybridizations, such as RFLP.Second Generation: 1990s -Based on PCR: Using random primers: RAPD, DAF, ISSR. Using specific primers:

5、 SSR, SCAR, STS -Based on PCR and restriction cutting: AFLP, CAPs.Third Generation: recently -Based on DNA point mutations (SNP), can be detected by SSCP, DNA chip, sequencing etc.酶切擴增多態(tài)性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）Molecular Markers Classes 1974年，Grozdicker等人首創(chuàng)了DNA分子標記，即第一代DNA分子標記：

6、限制性片段長度多態(tài)性標記 （RFLP） 1982年，Hamande發(fā)現(xiàn)了第二代DNA分子標記：簡單序列重復標記（SSR） 1990年，Williams和Welsh等發(fā)現(xiàn)了隨機擴增多態(tài)性DNA標記（RAPD） 1993年，Zebeau和Vos發(fā)明了擴增片段長度多態(tài)性標記（AFLP） 1994年，Zeitkiewicz等等發(fā)明了簡單重復見序列標簽（ISSR） 1998年，第三代DNA分子標記SNP誕生 隨后，大量的分子標記技術被發(fā)展了起來宏觀微觀個體居群生物群落組織細胞分子生態(tài)系統(tǒng)器官分子標記的特點對理想的遺傳標記的要求：具有高的多態(tài)性 共顯性遺傳（鑒別二倍體中雜合和純合基因型）能夠明確辨別等位基

7、因 分布于整個基因組中 選擇中性（即無基因多效性） 檢測手段簡單快速（如實驗程序易自動化） 開發(fā)成本和使用成本盡量低廉 在實驗室內(nèi)和實驗室間重復性好（便于數(shù)據(jù)交換） DNA分子標記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn) 基于DNA分子標記的分子標記技術大致可分為五大類分子標記技術的類型1）以Southern雜交為基礎的分子標記技術 限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性標記（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 單鏈構象多態(tài)性RFLP（sing strand conformation polymorphism-RFLP, SSCP-RFLP） 變性梯度凝膠電泳R

8、FLP（denaturing gradient gel electrophoresis-RFLP，DDGCE-RFLP） 原位雜交（in situ hybridization）2）以PCR為基礎的分子標記 隨機擴增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD） 序列標記位點（sequence tagged site, STS） 序列特征化擴增區(qū)域（sequence characterized amplified region, SCAR）技術 隨機引物PCR（random primer-PCR, RP-PCR） 任意引物PCR（arbitrar

9、y primer-PCR, AP-PCR） 寡核苷酸引物PCR（oligo primer-PCR, OP-PCR） 單鏈構象多態(tài)性PCR（single strand conformation polymorphism-PCR, SSCP-PCR）什么是STSs：即序列位置標簽（Sequence Tagged Site）是指一小段DNA片段（200500個堿基對），它的精確位置和堿基順序已經(jīng)明確的。由于每個STS都是唯一的，一對唯一的PCR引物對應一個STS，通過PCR反應中也可以檢測出STS來，STS適宜于作為人類基因組的一種地標，據(jù)此可以判定DNA的方向和特定序列的相對位置。ETS是cDNA

10、上的STS。NCBI建有STS數(shù)據(jù)庫，既可以查詢STS,也可以提交，url: /dbSTS/index.htmlDefinition in English: Short tagged tracts of DNA sequence (200 to 500 base pairs) that is operationally unique and has a single occurrence in the human genome. Their location and base sequence are known and therefore they can be used as landma

11、rks in genome mapping. They can be detected by the polymerase chain reaction in the presence of all other genomic sequences). Sequence-tagged sites are useful for mapping the sequence data reported from different laboratories and provide a framework for the physical map of the human genome. The over

12、whelming advantage of sequence-tagged sites over mapping landmarks defined through other methods is that the method can be completely described as information in a database. Expressed sequence tags are sequence tagged sites derived from cDNAs. 網(wǎng)絡資料 小寡核苷酸DNA分析（small oligo DNA analysis, SODA） DNA擴增指紋技

13、術（DNA amplification fingerprinting, DAF） 擴增片斷長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 相關序列擴增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP） 靶位區(qū)域擴增多態(tài)性（target region amplified polymorphism, TRAP） 插入/缺失多態(tài)性（insertion/deletion polymorphism, InDel 或I/D）RAPD 原理示意圖DNA提取選擇隨機引物PCR反應凝膠電泳圖譜分析RAPDA

14、FLPGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAPCRABCSSRISSR（inter-simple sequence repeat）-CACACACACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACACACACA-5錨定引物5錨定引物NNNN(CA)nNNNN(CA)nNN(CA)nNN(CA)n3錨定引物3錨定引物-3錨定引物的PCR產(chǎn)物CACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

15、GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACA5錨定引物的PCR產(chǎn)物簡單重復序列間區(qū)cDNA 文庫ESTRACE公共數(shù)據(jù)庫全長cDNA克隆電腦克隆基因表達譜分析5）以 單核苷酸多態(tài)性為基礎的分子標記技術 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 DNA分子標記多態(tài)性的產(chǎn)生有其分子的基礎 生物個體在DNA水平上的差異（或多態(tài)）是DNA分子標記能進行檢測和分析的基礎 DNA分子標記多態(tài)性的原理Point Mutation at

16、restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)B. Insertion or deletion between restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)C. Changes in the number of repeat unit between restriction sites or PCR primer sites: SSR, V

17、NTR, ISSRD. Mutations at single nucleotides: SNPPolymorphism of DNA Markers根據(jù)DNA標記產(chǎn)生的方式也可以對所有標記進行簡單的歸類：Comparison among genetic markersDNA分子標記技術具有諸多優(yōu)點廣泛應用： 植物分子遺傳圖譜的構建 植物遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定 重要的農(nóng)藝性狀基因定位與圖位克隆 轉(zhuǎn)基因植物鑒定和分子標記輔助選擇育種 取得驚人的成績，具有廣闊的應用前景成 績 考 核精讀1或多篇用分子標記技術探索某一科學問題的有影響的文章，寫一篇評述。題目自擬，制成A3正反面海報(相當于A4紙， 4頁), 字號自定。內(nèi)容包括：作者（如Fritsch et al.)、年份、文章標題，期刊、卷、起止頁碼摘要研究背景 （1）相關研究進展 （2）科學問題是什么？研究方法 使用何種分子標記技術？是否結(jié)合其他方法？研究結(jié)果與分析 簡明扼要，文字以5段左右為宜，要求能說明問題的