酶生物傳感器市公開課金獎(jiǎng)市賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

1、1第四章 酶生物傳感器 Enzyme Biosensor 一、酶本質(zhì)與特征 酶本質(zhì) 酶是生物體內(nèi)產(chǎn)生、含有催化活性一類蛋白質(zhì)。 依據(jù)化學(xué)組成份為兩大類，即單純蛋白酶與結(jié)合蛋白酶。 依據(jù)酶催化反應(yīng)類型分為氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、異構(gòu)酶等。 第1頁2 酶基本特征 酶高效催化性 酶催化效率通常比普通催化劑高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是經(jīng)過降低反應(yīng)所需活化能實(shí)現(xiàn)。 第2頁3 酶高度特異性 酶不但含有普通催化劑加緊反應(yīng)速度作用，而且含有高度特異性。 絕對特異性 相對特異性 立體異構(gòu)特異性第3頁4酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶反應(yīng)速度及各種原因?qū)γ阜磻?yīng)速度影響科學(xué)。 主要影響原因

2、包含有：底物濃度、酶濃度、 pH值、溫度、抑制劑與激活劑等。 第4頁5 酶動(dòng)力學(xué)測定是初速度，是指酶在反應(yīng)過程中底物初始濃度被消耗在5%以內(nèi)速度。目標(biāo)是排除酶反應(yīng)過程中出現(xiàn)各種干擾原因，方便測得準(zhǔn)確酶反應(yīng)速度。 第5頁6底物濃度對酶促反應(yīng)速度影響 第6頁7酶濃度對酶促反應(yīng)速度影響 若底物初始濃度固定時(shí)，酶反應(yīng)速度與酶濃度呈線性關(guān)系。第7頁8溫度對酶促反應(yīng)速度影響 每一個(gè)酶催化反應(yīng)都有適宜溫度范圍和最適溫度。第8頁9pH對酶促反應(yīng)速度影響 每一個(gè)酶都有適宜pH值范圍和最適pH值。在一定pH下，酶促反應(yīng)含有最高反應(yīng)速度，此pH稱為該酶最適pH。 第9頁10第10頁11抑制劑、激活劑對酶促反應(yīng)速度影

3、響 凡能降低酶活性甚至使酶完全失活物質(zhì)稱為抑制劑，抑制劑種類很多，包含藥品、抗生素、毒物、抗代謝物以及酶促反應(yīng)產(chǎn)物等。第11頁12 凡能激活酶活性物質(zhì)，均稱激活劑。一些酶必須有激活劑存在，才能進(jìn)行酶促反應(yīng)。激活劑大部分為一些無機(jī)離子，也有一些有機(jī)分子。 第12頁13二、酶傳感器 酶傳感器是應(yīng)用固定化酶作為敏感元件與各種信號(hào)轉(zhuǎn)換器組合而成生物傳感器。 依據(jù)信號(hào)轉(zhuǎn)換器類型，酶傳感器大致可分為酶電極、酶場效應(yīng)管傳感器、酶熱敏電阻傳感器、酶壓電晶體型、光纖光學(xué)型等。 第13頁14 傳感器類型第14頁154.1 酶電極傳感器 Enzyme electrode sensor 酶電極是由固定化酶與電流型電極

4、或電位型電極組合而成生物傳感器。 含有酶分子識(shí)別和選擇催化功效，又有電化學(xué)電極響應(yīng)快、操作簡便特點(diǎn)，能快速測定試液中某一給定化合物濃度，且需極少許樣品。 第15頁16電流型酶電極 電流型酶電極是將酶促反應(yīng)產(chǎn)生物質(zhì)在電極上發(fā)生氧化或還原反應(yīng)產(chǎn)生電流作為測量信號(hào)，在一定條件下，利用測得電流信號(hào)與被測物活度或濃度函數(shù)關(guān)系，來測定樣品中某一生物組分活度或濃度。第16頁17制作生物傳感器最慣用是氧化酶： 底物+O2 產(chǎn)物+H2O2第17頁18 基礎(chǔ)電極可采取氧、過氧化氫電極，還可采取近年開發(fā)介體修飾炭、鉑、鈀和金等固體電極或介體修飾電極。第18頁19 氧電極：是一個(gè)經(jīng)過測定電解電流來測定溶液中氧含量電解

5、池。 工作時(shí)，在鉑陰極和Ag陽極之間施加0.6V電壓。當(dāng)E=-0.2V時(shí)電極開始電解，產(chǎn)生還原電流，其還原反應(yīng)式為：第19頁使用最多是封閉式Clark氧電極第20頁21 鉑電極與Ag電極組合在一起置于參比溶液中，與被測溶液之間用透氧膜隔開。被測溶液中溶解氧經(jīng)過膜擴(kuò)散到電解質(zhì)溶液薄層，再擴(kuò)散到鉑電極表面進(jìn)行還原產(chǎn)生電流。第21頁H2O2電極H2O2電極基本測量電路和電壓-電流曲線 第22頁 兩極間外加一定電壓，實(shí)際測量時(shí)，外加電壓控制在電壓-電流曲線平滑部分，即0.7-0.9V，此時(shí)輸出電流就與濃度成百分比。陽極反應(yīng)陰極反應(yīng) 第23頁24第24頁251.葡萄糖傳感器 葡萄糖傳感器是研究最早、開發(fā)

6、最成熟并已市場化生物傳感器，即血糖儀。各種型號(hào)血糖儀產(chǎn)品第25頁26（1）早期葡萄糖傳感器 早期葡萄糖傳感器是由葡萄糖氧化酶膜和電化學(xué)電極組成。在電化學(xué)電極透氣膜上固定葡萄糖氧化酶。第26頁27當(dāng)葡萄糖溶液與酶膜接觸時(shí)，發(fā)生以下反應(yīng)：第27頁28故葡萄糖濃度測試方法有三種： 生成葡萄糖酸 消耗氧 生成H2O2第28頁29測量葡萄糖酸葡萄糖傳感器： pH電極和離子敏場效應(yīng)管測定葡萄糖酸量來計(jì)算樣品中葡萄糖含量，最低檢測限為10-3 molL，靈敏度較低；第29頁測量氧消耗量葡萄糖傳感器：30 Clark氧電極用于測定酶促反應(yīng)中氧消耗量(電流降低量)來計(jì)算樣品中葡萄糖含量，最低檢測限為10-4 m

7、olL 。第30頁31 葡萄糖氧化產(chǎn)生H2O2， H2O2經(jīng)過選擇性透氣膜，在Pt電極上氧化，葡萄糖含量與生成電流成正比，由此可測出葡萄糖濃度。 檢測H2O2方法本底電流小，靈敏度高，其最低檢出限為10-8molL。測量H2O2生成量葡萄糖傳感器：第31頁32（2）改進(jìn)葡萄糖傳感器 為消除環(huán)境中氧對測定干擾，用四硫富瓦烯、二茂鐵等輕易在電極上氧化還原介體來代替氧電子傳遞作用。電子介體是酶氧化還原活性中心與電極表面之間電子傳遞中介物，在電流型酶電極中起著關(guān)鍵性作用。 各種電子傳遞介體使用，使得電流型酶傳感器響應(yīng)速度、檢測靈敏度和選擇性都得到了很大提升。第32頁33 方法：將葡萄糖氧化酶和電子介體

8、同時(shí)包埋于聚合物膜中，或直接修飾于電極表面組成葡萄糖酶傳感器。第33頁34 在葡萄糖氧化酶（ ）催化下，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸，再由二茂鐵離子將還原型葡萄糖氧化酶（ ）氧化為氧化型葡萄糖氧化酶（ ），然后二茂鐵在電極上氧化成二茂鐵離子，經(jīng)過二茂鐵在電極上產(chǎn)生氧化電流來實(shí)現(xiàn)葡萄糖含量檢測。第34頁35介體傳感器特點(diǎn)：僅用較低電壓就能使介體氧化。傳感器對氧不敏感，能在缺氧和氧濃度 改變條件下使用。二茂鐵離子與還原GOD之間電子傳遞 快，電極響應(yīng)快速。第35頁36 采取場效應(yīng)晶體管和微電極做換能器，以縮小傳感器體積； 利用電子技術(shù)、改進(jìn)信號(hào)放大和顯示方法，使其易于商品化； 改進(jìn)采樣方法，使患者使用方

9、便或更易于臨床應(yīng)用。 最主要改進(jìn)是使用化學(xué)電子傳遞中間介體代替作為自然電子受體氧，使酶催化反應(yīng)不再受到溶解氧含量制約。第36頁37（3）血糖儀測試片血糖儀測試片 第37頁38手表式葡萄糖傳感器第38頁第39頁40 手表式無創(chuàng)血糖儀是近年來出現(xiàn)一個(gè)無創(chuàng)、無痛，能連續(xù)測定血糖設(shè)備。它經(jīng)過電化學(xué)傳感器和電滲透原理來檢測皮下組織液中葡萄糖濃度，無需針刺采血。 手表式血糖儀測定是組織間液葡萄糖值，所以要略滯后于指血血糖值。 第40頁41(2)乳酸電極 血液中乳酸濃度是反應(yīng)人體體力消耗程度主要指標(biāo)。在體育運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中乳酸檢驗(yàn)是極為必要，國際上乳酸傳感器已經(jīng)有成熟商品儀器。第41頁第42頁43 還可采取介體修

10、飾方法制備乳酸傳感器。 在電極上滴介體四硫富瓦烯(TTF)漿液，晾干后，將乳酸氧化酶固定在該電極表面修飾層上面，即組成乳酸傳感器。第43頁44第44頁45 在乳酸氧化酶催化下，乳酸被氧化為丙酮酸，再由四硫富瓦烯離子將還原型乳酸氧化酶氧化為氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在電極上氧化成四硫富瓦烯離子，經(jīng)過四硫富瓦烯在電極上產(chǎn)生氧化電流來實(shí)現(xiàn)乳酸含量檢測。第45頁46(3)膽固醇電極 膽固醇電極是一個(gè)用于臨床測定血清膽固醇含量電流型酶傳感器。血液中膽固醇約有23以酯型存在，13以游離型存在。第46頁 自然界中膽固醇主要存在于動(dòng)物性食物之中，植物中沒有膽固醇。 獸肉膽固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，

11、貝殼類和軟體類高于普通魚類，蛋黃、魚子、動(dòng)物內(nèi)臟膽固醇含量非常高。 第47頁降低膽固醇食物： 含膳食纖維豐富食物 VC 與 VE 飲酒可能使血中高密度脂蛋白升高，加強(qiáng)防治高膽固醇血癥作用。葡萄酒較適當(dāng)，但必須嚴(yán)格限制攝入量。 第48頁49 膽固醇電極是一個(gè)用于臨床測定血清膽固醇含量電流型酶傳感器。結(jié)合型酶電極第49頁50 依據(jù)反應(yīng)過程中消耗氧，產(chǎn)生過氧化氫，用對應(yīng)電極組成膽固醇傳感器測定電流改變量，在一定條件下，電流改變量與膽固醇濃度呈線性相關(guān)。第50頁51(4）肌酸和肌酸酐電極脫水肌酸肌酸酐第51頁 血清肌酸肝含量測定是衡量腎功效一個(gè)很好基準(zhǔn)。 血清肌酸酐濃度不會(huì)因食物種類而受影響，所以做為

12、判斷腎臟機(jī)能依據(jù)較血清尿素可靠。 血清肌酸酐濃度與肌肉量相關(guān)，所以肌肉多排放尿肌酸酐濃度會(huì)比肌肉少多。 第52頁53第53頁54 肌酸和肌酸酐微傳感器第54頁55（5）磷酸鹽電極佝僂病軟骨病第55頁56葡萄糖-6-磷酸鹽葡萄糖 + 磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第56頁57（6）淀粉電極淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第57頁58（7）乙醇電極CH3CH2OH 可用乙醇來制造醋酸、飲料、香精、染料、燃料等。 醫(yī)療上也慣用體積分?jǐn)?shù)為70-75%乙醇作消毒劑等。 第58頁酒后駕駛飲酒駕車：指駕駛員血液中酒精含量大于或等于20 m

13、g/100 mL小于80 mg/100 mL駕駛行為。 350 mL(約相當(dāng)于1小瓶)啤酒或半兩白酒(20 mL)第59頁醉酒駕車：指駕駛員血液中酒精含量大于或等于80 mg/100 mL駕駛行為。 1400 mL(約相當(dāng)于3瓶500 mL)啤酒或一兩半白酒(80mL) 第60頁C2H5OH + NAD+CH3CHO + NADH醇脫氫酶NADH + Fe(CN)64-NAD+ + Fe(CN)63- + H+ + e-第61頁62（二）電位型酶電極 電位型酶電極是將酶促反應(yīng)所引發(fā)物質(zhì)量改變轉(zhuǎn)變成電位信號(hào)輸出，電位信號(hào)大小與底物濃度對數(shù)值呈線性關(guān)系。 第62頁電位型酶電極所用基礎(chǔ)電極是對某種離

14、子有選擇性或?qū)怏w有選擇性電極離子選擇性電極氣敏電極第63頁64第64頁 1773年，伊萊爾羅埃爾（Hilaire Rouelle）發(fā)覺尿素。 1828年，德國化學(xué)家弗里德里希維勒首次使用無機(jī)物質(zhì)氰酸氨（由氯化銨和氯酸銀反應(yīng)制得）與硫酸銨人工合成了尿素。 弗里德里希維勒（Friedrich Wohler）尿素電極 第65頁尿素分子模型增高：急性或慢性腎小球腎炎、腎功效衰竭、尿路阻塞、尿路腫瘤、高蛋白質(zhì)飲食等。減低：妊娠后期、蛋白質(zhì)攝入不足、營養(yǎng)不良等。第66頁67 尿素在脲酶作用下發(fā)生水解反應(yīng)可用氨氣敏電極、二氧化碳電極等作為基礎(chǔ)電極測定尿素含量。 第67頁（2）草酸電極草酸（乙二酸）結(jié)構(gòu)式

15、維生素C代謝 甘氨酸代謝 草酰乙酸水解 異檸檬酸降解 食物攝入：菠菜、茶葉 生物體內(nèi)草酸起源：第68頁草酸 草酸脫羧酶2CO2 + 甲酸第69頁（3）腺苷電極 參加心肌能量代謝 擴(kuò)張血流量 合成ATP、腺苷酸主要中間體第70頁腺苷腺嘌呤脫氨基酶肌苷 + NH3第71頁（4）苯丙氨酸電極 哺乳動(dòng)物必需氨基酸 是甜味劑阿斯巴甜主要原料第72頁苯丙氨酸苯丙氨酸胺裂解酶反式肉桂酸鹽+ NH3第73頁744.2 酶場效應(yīng)晶體管傳感器(ENFET) ENFET將酶膜復(fù)合在ISFET柵極。 測量時(shí)，酶催化作用使待測分子反應(yīng)生成ISFET能夠響應(yīng)離子。 第74頁ISFET工作原理第75頁76 敏感膜與溶液界面

16、產(chǎn)生膜電位，該電位疊加在柵壓上，引發(fā)場效應(yīng)管漏電流改變。依據(jù)能斯特方程，膜電位大小與溶液中離子活度相關(guān)，即:第76頁77（一）葡萄糖-FET 葡萄糖-FET是由對H+ 敏感ISFET和固定在其柵極上葡萄糖氧化酶膜組成。第77頁78 酶催化底物反應(yīng)時(shí)，生成葡萄糖酸根、H+ 和過氧化氫，造成酶膜附近pH值改變，且pH改變量與葡萄糖含量相關(guān)。 溶液中H+濃度改變，離子敏感膜與溶液界面膜電位發(fā)生改變，該電位疊加在柵源電壓上，柵源電壓改變與溶液中pH值改變量成線性關(guān)系。葡萄糖-FET工作原理：第78頁 為提升葡萄糖-FET工作性能和測量精度，可采取兩個(gè)pH敏感場效應(yīng)管組成差動(dòng)式結(jié)構(gòu)。雙柵極酶-FET傳感

17、器第79頁80 一個(gè)FET柵極固定葡萄糖氧化酶膜，作為工作FET；另一個(gè)FET柵極上沒有酶膜，作為參比FET。將2個(gè)FET接到差動(dòng)放大器上，干擾原因被消除，使輸出電壓只對葡萄糖響應(yīng)，所以輸出電壓改變能夠反應(yīng)葡萄糖含量改變。第80頁81（二）尿素-FET 尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜組成，其原理是利用pH-FET檢測脲酶水解尿素時(shí)溶液pH發(fā)生改變。 第81頁 第82頁83 尿素傳感器也可采取差動(dòng)結(jié)構(gòu)，使用兩個(gè)FET，一個(gè)是固定有尿素酶FET ，另一個(gè)則是沒有固定尿素酶FET，作為參比FET，利用運(yùn)算放大器組成反饋電路。 Ag/AgCl電極可使溶液電位保持一定。第83頁84第84頁85

18、 測定時(shí)因?yàn)殡迕复呋蛩胤磻?yīng)時(shí)造成溶液中pH發(fā)生改變，從而造成溶液-界面上界面電位改變，經(jīng)差動(dòng)放大器后，輸出電壓與待測溶液尿素濃度相關(guān)。第85頁86其它應(yīng)用： 青霉素-FET L-谷氨酸-FET傳感器第86頁874.3 酶熱敏電阻傳感器 酶熱敏電阻傳感器是由固定化酶和熱敏電阻組合而成。 用酶熱敏電阻測定待測物含量是依據(jù)酶促反應(yīng)產(chǎn)生熱量多少來進(jìn)行。經(jīng)過溫度改變推測待測物含量。第87頁88酶熱敏電阻基本組成密接型柱式反應(yīng)器型第88頁89酶熱敏電阻測溫方式第89頁酶熱敏電阻測量系統(tǒng) 第90頁91酶載體特點(diǎn)： 機(jī)械強(qiáng)度高，耐壓性好； 固定化效率高； 化學(xué)及生物學(xué)穩(wěn)定性高。當(dāng)前，載體除多孔玻璃以外，還有

19、多糖類凝膠或尼龍制毛細(xì)管等。第91頁92優(yōu)點(diǎn)： 容量小、響應(yīng)快、穩(wěn)定性好、使用方便、價(jià)格廉價(jià)。 第92頁934.4 光纖光學(xué)型酶傳感器高錕生于1933年，取得諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)“光纖之父”第93頁94光纖傳感器組成：光纖生物敏感膜（探頭）光電換能器第94頁(c)單束光纖，生物敏感膜與光纖為一體生物敏感膜(a)雙束光纖 (b) 單束光纖， 生物敏感膜在端部光纖生物傳感器信號(hào)轉(zhuǎn)換器三種結(jié)構(gòu)第95頁光纖光學(xué)生物傳感系統(tǒng) 第96頁1.光纖生物傳感器特點(diǎn) 抗干擾能力強(qiáng)，不受電磁場干擾； 不用參比電極，能夠微型化； 實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離遙測； 響應(yīng)速度快，靈敏度高。第97頁2. 光纖酶傳感器工作原理 待測物質(zhì)從樣品溶液

20、中擴(kuò)散到生物敏感膜時(shí)，在固定化酶催化下生成一個(gè)待檢測物質(zhì)； 當(dāng)?shù)孜飻U(kuò)散速度與催化產(chǎn)物生成速度達(dá)成平衡時(shí)，即可得到一個(gè)穩(wěn)定光信號(hào)，依據(jù)光信號(hào)大小與底物濃度函數(shù)關(guān)系，得到底物濃度，普通情況下光信號(hào)大小與底物濃度成正比。第98頁3. 光纖酶傳感器分類 按照換能器能量轉(zhuǎn)換方式不一樣，分為化學(xué)發(fā)光型、光吸收型、熒光猝滅型、指示劑型和生物發(fā)光型。第99頁（1）化學(xué)發(fā)光型 一些化學(xué)反應(yīng)伴隨光子釋放，釋放光子即化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與待測物濃度呈線性關(guān)系。 但有些生化反應(yīng)不能釋放光學(xué)信號(hào)，需要引入中間物，使其轉(zhuǎn)變成能進(jìn)行光檢測信號(hào)。 第100頁 魯米諾（luminol）（3-氨基-鄰苯甲酰肼），又稱發(fā)光氨、光敏靈。在堿性條件下能被許多氧化劑（比如H2O2，ClO-等）氧化而發(fā)出藍(lán)色光，是研究最早、最多、應(yīng)用最廣泛發(fā)光試劑。第101頁谷氨酰胺 谷氨酸+NH3谷氨酸+O2+H2O 酮戊二酸+H2O2+ NH3魯米諾+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h谷氨酰胺酶谷氨酸氧化酶第102頁魯米諾+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h第103頁 GOD氧化葡萄糖，生成過氧化氫開啟魯米諾電化學(xué)發(fā)光，并經(jīng)過光纖傳感器檢測發(fā)光信號(hào)。酶促反應(yīng)和發(fā)光反應(yīng)同時(shí)發(fā)生，所以傳感器響應(yīng)非?？臁ｔ斆字Z+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h第104頁（2）光吸收型 假如被測物A不含有光學(xué)