DNA修飾及其檢測技術(shù)

1、第四節(jié)：DNA修飾DNA甲基化是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG島的CpG二核苷酸的胞嘧啶5碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)。 作用：是哺乳動物基因表達(dá)調(diào)控的主要形式。DNA甲基化特點(diǎn)：可遺傳的，即這類改變通過有絲分裂或減數(shù)分裂能在細(xì)胞或個體世代間遺傳；是基因表達(dá)的改變;沒有DNA序列的變化，或不能用DNA序列變化來解釋。1CpG島（CpG Island）CpG島（CpG Island）：成簇的CpG二聯(lián)體被稱為“CpG島”CpG島的結(jié)構(gòu)特征：一般以12kb的DNA長度范圍內(nèi)，（GC）含量超過60（正常的為20），并有高濃度的CpG二核苷酸，高出平均水平1020倍。CG島通常是一些稀有

2、的內(nèi)切酶的切點(diǎn)，如果基因組中這種限制位點(diǎn)的緊密成簇，則表明含有CG島，然后進(jìn)行Southern印跡可鑒定基因。人基因組內(nèi)有45000個CpG島，其中16000個在Alu序列中，還存在29000個CpG島;組成型表達(dá)的基因中100含有CpG，在組織特異性表達(dá)的基因中40有CpG。沒有甲基化的C極易變成U而被修復(fù)，甲基化C脫氨基后形成T，因此CpG序列容易丟失。在兩個CpG島之間有810堿基的重復(fù)序列，該序列決定了甲基化發(fā)生的地點(diǎn)。2DNA甲基化的作用CpG占基因組的10，其中7080為甲基化。未甲基化的CpG島處于組成性表達(dá)基因啟動子的周圍；也存在于一些組織特異性基因的啟動子周圍CpG島的甲基化

3、改變了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成高度螺旋化，失去了DNase敏感性，阻止了啟動子的活化，同時能夠與甲基化CpG結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合，如組蛋白去乙?；傅?，可以抑制基因的表達(dá)。甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感轉(zhuǎn)錄因子E2F、CREB、A P2、NF2KB、Cmyb、Ets使其失去結(jié)合DNA的功能，阻斷轉(zhuǎn)錄甲基化CPG 粘附分子可作用于甲基化非敏感轉(zhuǎn)錄因子(SP1、CTF、YY1) , 使它們失活, 從而阻斷轉(zhuǎn)錄。5 種帶有甲基化DNA 結(jié)合域(MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白(MECP2、MBD1、MBD2、MBD3；MBD1 )有糖基轉(zhuǎn)移酶活性, 可將T 從錯配堿基對TG 中移去。3用組蛋白Hl與含C

4、CGG序列的甲基化和非甲基化DNA實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)：甲基化達(dá)到一定程度時會發(fā)生從常規(guī)的B-DNA向Z-DNA的過渡。又由于Z-DNA結(jié)構(gòu)收縮，螺旋加深，使許多蛋白質(zhì)因子賴以結(jié)合的元件縮入大溝而不利于基因轉(zhuǎn)錄的起始。DNA甲基化導(dǎo)致某些區(qū)域DNA構(gòu)象變化，影響蛋白質(zhì)與DNA的相互作用；抑制轉(zhuǎn)錄因子與啟動區(qū)DNA的結(jié)合效率。用序列相同但甲基化水平不同的DNA為材料，比較其作為RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄模板的活性，發(fā)現(xiàn)甲基的引入不利于模板與RNA聚合酶的結(jié)合，降低了其體外轉(zhuǎn)錄活性。5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是隨機(jī)分布的，基因的5端和3端往往富含甲基化位點(diǎn)，而啟動區(qū)DNA分子上的甲基化密度與基因轉(zhuǎn)錄受抑制的程度密切

5、相關(guān).4組織培養(yǎng)的細(xì)胞由于甲基化作用，使細(xì)胞系不能表達(dá)出相應(yīng)的組織特異性蛋白質(zhì)。 2006年制備了擬南芥的全基因組甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄區(qū)域1/3以上的表達(dá)區(qū)域出現(xiàn)了甲基化；而啟動子區(qū)有少于5的基因出現(xiàn)了甲基化；在轉(zhuǎn)錄區(qū)域的甲基化表現(xiàn)出了明顯的組織特異性。甲基化通常發(fā)生于外源序列中，使其處于異染色質(zhì)狀態(tài)，是寄主抵御外源序列入侵的策略，是1種主動防御機(jī)制。5DNA甲基化形成過程在DNA甲基化過程中，胞嘧啶DNA雙螺旋突出進(jìn)入與酶結(jié)合部位的裂隙，通過胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶把活性甲基從甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至5胞嘧啶位上，形成5甲基胞嘧啶。2類甲基轉(zhuǎn)移酶：維持甲基化的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmtl：使復(fù)制后形成的半甲基化

6、DNA進(jìn)行全甲基化；獲得與親本DNA完全相同的甲基化形式。S期：Dnmt1與其相關(guān)蛋白DMAP1共同定位于復(fù)制叉處重新甲基化的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b：在沒有甲基化的DNA雙鏈上進(jìn)行甲基化在不同的細(xì)胞周期其位置會發(fā)生改變，如小鼠成纖維細(xì)胞中Dnmt3a、異染色質(zhì)蛋白HP1以及甲基化DNA結(jié)合蛋白MeCP2都定位于復(fù)制晚期的異染色質(zhì)著絲粒周圍，而Dnmt3b則普遍存在于核內(nèi)；在胚胎干細(xì)胞中，Dnmt3a、Dnmt3b和HP1則都定位于著絲粒周圍。6CpG甲基化形成機(jī)制：甲基化酶：Dam甲基化酶：催化GATC中的A甲基化（原核）Dcm甲基化酶：催化CCGG中2位C甲基化（原核，

7、JM109,HB101）真核生物甲基化酶：CpG的C形成5甲基胞嘧啶維持甲基化酶（maintenance DNA methyltransferase) (dnmt1) :在甲基化雙鏈中只有親代是甲基化的，而子代為非甲基化。此酶識別親代甲基化位點(diǎn)，催化子代甲基化；對半甲基化的全甲基化催化效率非常高。一旦突變，導(dǎo)致全基因組去甲基化，引發(fā)胚胎死亡重新甲基化酶（de novo DNA methyltransferase)（dnmt3a和dnmt3b):使沒有甲基化的雙鏈發(fā)生甲基化；使早期胚胎發(fā)生重新甲基化；dnmt3b突變引發(fā)著絲粒不穩(wěn)定，面部畸形和致死性免疫缺陷。7甲基化與去甲基化去甲基化：被動途徑

8、: 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA , 使粘附點(diǎn)附近的DNA不能被完全甲基化, 從而阻斷DNM T1 的作用; 主動途徑: 是由去甲基酶的作用, 將甲基集團(tuán)移去。甲基化與去甲基化的動態(tài)變化：囊胚期達(dá)到去甲基化極點(diǎn)，著床后再甲基化；雄原核先去甲基化，雌原核在卵裂后去甲基化；羊在原腸前不去甲基化，原腸期達(dá)到甲基化極點(diǎn)，分化過程中才去甲基化。8CpG島影響基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制直接抑制轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，如HAT（組蛋白乙?；福A（輔助激活因子）、TF（基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子）；對甲基化敏感的TF有：AP-2,E2F,NFkB;不敏感的有Sp1?；虮磉_(dá)時需要核小體松散、組蛋白乙?；@樣可以吸引HAT、CA、T

9、F等轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合而啟動轉(zhuǎn)錄。但CpG甲基化后，結(jié)合5甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白（如MBD1,MBD2,MBD3T,MBD4,Mecp2等，methylcytosine-binding domains),激發(fā)去乙酰化酶，組蛋白恢復(fù)正常，染色體結(jié)構(gòu)改變而抑制基因表達(dá)。有些情況下，組蛋白出現(xiàn)去乙?；?，使得重新甲基化酶與CpG結(jié)合，引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)變化和CpG甲基化，抑制基因表達(dá)。9甲基化與基因印記：基因印記的概念：配子或合子在發(fā)生期間，來自親本的等位基因或染色體在發(fā)育過程中產(chǎn)生專一性加工修飾，導(dǎo)致后代體細(xì)胞中兩個親本來源的等位基因有不同的表達(dá)活性。既依賴于親本起源所引發(fā)等位基因表達(dá)不對稱現(xiàn)象。大部分印

10、記基因都有差異甲基化區(qū)域10CpG甲基化的鑒定免疫學(xué)法：標(biāo)記可以特異性識別5mC的抗體，測定熒光素強(qiáng)度（測定甲基化的含量）。Sss I甲基轉(zhuǎn)移酶：測定底物（S-腺苷甲硫氨酸）剩余量來推測甲基化程度（甲基化位點(diǎn)的含量）直接測序法：用亞硫酸氫鈉將胞嘧啶轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，通過對特定區(qū)域進(jìn)行PCR后轉(zhuǎn)變成T，通過比對查找甲基化位點(diǎn)酶切法：先酶切后擴(kuò)增，切開了不能形成目的片段11酶切消化法兩種酶切方法可以鑒定DNA甲基化SmaI - XmaI (CCCGGG)，此序列在基因組內(nèi)非常少。HpaII - MspI (CCGG)，較為常用。內(nèi)切酶MspI可以切開是否甲基化的CCGG序列；內(nèi)切酶HpaII對已經(jīng)甲基

11、化的CCGG序列不能切開，從而可以鑒定，是否甲基化。此方法的兩個缺陷：并不是所有的CpG均在CCGG序列中，會被低估要使用Southern雜交，比較繁瑣12亞硫酸氫鹽法利用亞硫酸氫鹽將DNA中的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)換成尿嘧啶（U）結(jié)合PCR反應(yīng)變成胸腺嘧啶（T） 過程：酶切消化DNA，將2g DNA溶于19 ml水中轉(zhuǎn)換液：107 l 4.04M NaHSO; 3, 7l 10 mM對苯二酚（Hydroquinone）和6l 6N NaOH，總體積120 l, pH 5.00. 將DNA溶液加入1l 6N NaOH， 37C培養(yǎng)15 min加入120 l轉(zhuǎn)換液， 95C變性30 sec，轉(zhuǎn)化處理50

12、C 轉(zhuǎn)化處理15 min，共計(jì)15個循環(huán)沉淀DNA用于后續(xù)反應(yīng).13甲基化特異性PCRMethylation Specific PCR U轉(zhuǎn)換引物設(shè)計(jì)兩對，3端設(shè)計(jì)到檢測點(diǎn)：一對檢測甲基化鏈另一對檢測非甲基化鏈放射性標(biāo)記,檢測甲基化敏感引物單核苷酸延伸U轉(zhuǎn)換PCR擴(kuò)增引物延伸標(biāo)記引物末端PCR片段有無檢測14COBRA方法結(jié)合重亞硫酸氫鹽的限制性內(nèi)切酶法U轉(zhuǎn)換PCR酶切消化15六、DNA的三級結(jié)構(gòu)鳥嘌呤之間的特異性相互作用造成G-四聯(lián)體，四個G有序地排列在一個正方形的片層中，相鄰堿基間以非正常的G-G氫鍵連接，形成首尾相連的環(huán)形結(jié)構(gòu)，片層中間是由電負(fù)性的羰基氧組成的口袋，可以容納一個一價的陽離

13、子。X光衍射技術(shù)證明，多聚鳥苷酸形成四螺旋的DNA結(jié)構(gòu)，整個四鏈結(jié)構(gòu)可以看成由多個G-四聯(lián)體片層以螺旋形式堆積起來，分別來自四條多聚鳥苷酸鏈。螺旋的扭角為30度、螺距34A、G糖苷鍵為反式結(jié)構(gòu)、磷酸骨架采取平行的5-3排列方式。16圖 解17真核生物染色體的端粒中，有許多富含鳥嘌呤的串聯(lián)重復(fù)序列：尖毛蟲端粒：d（TTTTTGGGGG）n四膜蟲端粒： d（TTGGGG）n人類端粒： d（TTAGGG）n這些富含G序列總是位于端粒的3端、其5端為富含C的序列，因此端粒在一定條件下可能采取與Poly（G）類似的四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。18在端粒DNA中也發(fā)現(xiàn)了許多G-四聯(lián)體的特征在非變性電泳中，端粒表現(xiàn)出很高的泳動性，表明具有很好的壓縮狀態(tài)；端粒DNA特殊結(jié)構(gòu)的形成也需要一價陽離子的存在；在一定條件下，端粒DNA表現(xiàn)出對單鏈核酸酶的抗性；核磁共振表明端粒中有G-G氫鍵的形成。19端粒與PolyG相比又表現(xiàn)出新的特征串聯(lián)重復(fù)的G相互配對形成G-四聯(lián)體，將導(dǎo)致D