微波輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定蔬果中的vc含量

1、微波輔助提取-高效液相色譜法測(cè)定蔬果中的維生素 C 含量（12322042），丙 5 實(shí)驗(yàn)組（中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)，廣州，510275）摘要維生素 C 是蔬果中重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一。本文通過(guò)微波輔助方法萃取處理了橙子、辣椒、番茄與蓮霧樣品，并采用高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器高效液相色譜測(cè)定樣品中的維生素C 含量。實(shí)驗(yàn)以 3% 的乙腈-0.05 mol/LKH2PO4 水溶液作（HPLC）為相，以維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對(duì)其濃度做校準(zhǔn)曲線，根據(jù)微波輔助萃取樣品中維生素 C 的峰面積，由校準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：橙子樣品維生素C 含量為 18.88mg/100g，辣椒樣品維生素C

2、含量為 5.42 mg/100g，番茄樣品維生素C 含量為 6.31mg/100g，蓮霧樣品無(wú)法定性、定量分析。維生素C1 引言維生素C（L-ascorbic acid），又稱抗壞血酸（AH2)，分子式為 C6H8O6，應(yīng)用廣泛，其對(duì)人體新陳代謝及生命活動(dòng)中許多方面具有重要的影響。由于維生素 C 在體內(nèi)不能，所以必須依靠膳食供給，而水果，蔬菜中維生素C 的含量較高的植物有：獼猴桃、青椒、苦瓜等。若缺乏維生素C 則會(huì)得壞血病、關(guān)節(jié)疼痛、牙齦、發(fā)炎、易疾病，身體骨骼易損傷且不易中常用作抗氧化劑，酸味劑。可見(jiàn)，維生素 C 對(duì)人類的健康和日常生愈合。另外，在活有著極其重要的影響，因此，對(duì)維生素C 的研

3、究得到日益廣泛的重視1-3。維生素C 的測(cè)定方法有很多，各種方法各有特點(diǎn)，常用的滴定法方法簡(jiǎn)單，但在滴定有色物質(zhì)時(shí)，終點(diǎn)不易判斷，維生素C 的吸收峰在 265nm 處，含量的分析本可以使用紫外-可見(jiàn)分光光度法解決，但是由于蔬果中成分較復(fù)雜，其它成分有可能會(huì)對(duì)維生素 C 的吸收造成直接干擾。而分光光度法操作費(fèi)時(shí)4。因此必須更加有效的分離方法以及檢測(cè)系統(tǒng)。因此選取高效液相色譜進(jìn)行定量與定性分析。，高效液相色譜法是目前發(fā)展較快的一種檢測(cè)方法，其具有高效、快速、穩(wěn)定、可靠等特點(diǎn)。本文采用微波輔助技術(shù)作樣品前處理。微波輔助技術(shù)處理樣品最突出特點(diǎn)是反應(yīng)速度極快,節(jié)時(shí)和節(jié)能,產(chǎn)率高,而且環(huán)境友好。其中微波輔

4、助提取萃取(MAE)是利用微波與介質(zhì)的離子和偶極子分子的相互作用，可縮短提取時(shí)間、節(jié)省試劑、減少污染、提高萃取率等優(yōu)勢(shì),在環(huán)境、食品、制藥等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用5。因此本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助萃取法快速萃取蔬果中的維生素C，采用高效液相色譜進(jìn)行分析，以維生素C 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的色譜峰面積對(duì)其濃度做校準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品中維生素 C 的峰面積，由校準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1.1 儀器高效液相色譜儀：LC-2010C（）；微波萃取儀（新儀微波化學(xué)科技有限公司）；色譜柱：Phenomenex C18 柱(250 mm4.6 mm, I.D. 5 m)；平頭進(jìn)樣器。2.1.2 試劑乙腈（色譜純），冰乙

5、酸，維生素 C，磷酸二氫鉀等均為分析純；番茄、黃瓜、蓮霧等蔬果樣品。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。維生素C 標(biāo)準(zhǔn)溶液：快速準(zhǔn)確稱取 0.025 g 維生素C，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量轉(zhuǎn)移至 250 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，得到 100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液備用，現(xiàn)用現(xiàn)配。2.1.3 色譜條件相：3%的乙腈-0.05 mol/L KH2PO4 水溶液（v/v）；流速 1 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 265 nm；自動(dòng)進(jìn)樣量 10 L。2.2 實(shí)驗(yàn)步驟2.2.1 樣品處理準(zhǔn)確稱取切碎的橙子、辣椒、番茄與蓮霧樣品各 5 g，分別以 50 mL 1 mol/L 乙酸為萃取溶劑

6、萃取，微波功率設(shè)為自動(dòng)，萃取時(shí)間為 10 min，萃取溫度設(shè)定為 50。萃取液過(guò)濾后用 1mol/L乙酸溶液定容至 100 mL，制成供試品溶液。2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制分別準(zhǔn)確移取 0.50、2.00、5.00、8.00、10.00 ml 100 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液于 10 ml 容量瓶中，用 1mol/L 乙酸溶液定容，則得到質(zhì)量濃度為 5，20，50，80，100 mg/L 的維生素C 樣品溶液。待液相色譜儀穩(wěn)定工作后進(jìn)樣分析。以維生素C 色譜峰面積對(duì)濃度作圖，繪制校準(zhǔn)曲線。2.2.3 定量分析0.45m 微孔濾膜器過(guò)濾后注入注射器中，供試的橙子、辣椒、番茄與蓮霧樣品溶液經(jīng)再注入色

7、譜小瓶?jī)?nèi)，按指定色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，樣品溶液的維生素C 色譜峰面積，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算蔬果樣品中維生素C 的含量，結(jié)果以mg/100g 表示。3 結(jié)果與3.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜小瓶后在液相色譜儀中檢測(cè)，其保留時(shí)間與峰面積，見(jiàn)表 1：表 1 維生素 C 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜中的保留時(shí)間與峰面積標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/mgL-1保留時(shí)間tR/min峰面積52.738159434202.743706243502.7551832329802.76328483891002.7583626137根據(jù)表 1，用Origin 擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得圖 1 如下：圖 1 維生素C 系列溶液標(biāo)

8、準(zhǔn)曲線如圖 1 所示，線性回歸方程A（峰面積）= 36270c15246，其中相關(guān)系數(shù) R 為 0.9997。3.1.2 色譜圖的還原及定性分析表 2樣品色譜中維生素 C 的保留時(shí)間與峰面積質(zhì)量/g保留時(shí)間tR/min峰面積(265nm)樣品4.99722.740326903橙子辣椒5.00502.73883183番茄5.08952.7481013185.00102.624 或2.848（無(wú)法確定）蓮霧無(wú)法確定以保留時(shí)間t(min)為橫坐標(biāo)，峰高ensity 為縱坐標(biāo)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Origin 作出樣品色譜曲線，各樣品溶液的色譜圖如下：圖 2圖 4 番茄樣品色譜圖橙子樣品色譜圖圖 3圖 5 蓮

9、霧樣品色譜辣椒樣品色譜圖由圖 2-4 及表 2 中可見(jiàn)，橙子、番茄、辣椒均在 2.7min 的保留時(shí)間獲得最大的峰，與標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定出的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，從定性的角度證明了維生素C 的存在；但是由圖 5 及表 2 中也發(fā)現(xiàn)了：蓮霧樣品在 2.7min 出現(xiàn)的卻是低谷，在 2.624min 與 2.848min時(shí)獲得兩個(gè)高度相近的峰，從而無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。具體的誤差分析見(jiàn)后敘述。3.1.3 定量分析樣品溶液中維生素 C 的含量由于蓮霧樣品無(wú)法準(zhǔn)確判定哪個(gè)才是維生素 C 對(duì)應(yīng)的峰，所以只將橙子樣品、辣椒樣品、番茄樣品維生素C 峰面積(326903，83183,101318 )，代入工作曲線方程，A

10、= 36270c 15246中得出進(jìn)樣樣品溶液中維生素C 濃度，再按照萃取前稱取的樣品質(zhì)量（見(jiàn)表 1），計(jì)算式如下：m(維生素C 含量) =算出橙子樣品維生素 C 含量為 18.88mg/100g，辣椒樣品維生素 C 含量為 5.42 mg/100g，番茄樣品維生素C 含量為 6.31mg/100g。實(shí)際上，辣椒與番茄的峰面積沒(méi)有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度5mg/L 的峰面積 159434。如果用此數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，與實(shí)際含量的誤差會(huì)變大。因此，辣椒與番茄的峰面積數(shù)據(jù)并不能作為維生素C 含量的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)來(lái)源，只能作粗略估計(jì)用。3.2 實(shí)驗(yàn)3.2.1 誤差分析高效液相色譜定量分析過(guò)程可分為樣品的前處理、標(biāo)準(zhǔn)

11、品的配制、進(jìn)樣、色譜分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等七個(gè)步驟。隨著現(xiàn)在市場(chǎng)銷(xiāo)售儀器自動(dòng)化程度的提高，進(jìn)樣、色譜分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的誤差越來(lái)越小，尤其在高效液相色譜定量分析中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差可能主要來(lái)源于樣品的前處理及標(biāo)準(zhǔn)品的配制。/z/yiqi/2011/0109/118745.html）（摘自 HYPERLINK http:/w/ http:/w我將根據(jù)以下兩點(diǎn)提出關(guān)于實(shí)驗(yàn)的與經(jīng)驗(yàn)：一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制中使用到容量瓶和移液管，這些量具本身會(huì)引入一定的不確定度；二維生素 C 具有較強(qiáng)的還原性，它易受空氣、熱、光、等的影響，因此在樣品以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制，甚至色譜測(cè)量過(guò)程中維生素 C 的

12、分解或變質(zhì)可能引入較大的不確定度；（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，配制過(guò)程洗滌，取液，移液過(guò)程都沒(méi)有發(fā)生交叉污染。值得注意的是，在將維生素C 直接轉(zhuǎn)移入 10mL 容量瓶配制成同濃度的標(biāo)液時(shí)，忽視了同濃度的細(xì)節(jié)，直接用移液管向容量瓶加入 10mL 樣液，由于容量瓶?jī)?nèi)有一定殘余洗滌液，所以導(dǎo)致最后體積超過(guò)了刻度線，需要重配。應(yīng)該用配制溶液的方法，最后定容到刻度更妥當(dāng)。而精確度可以由線性方程相關(guān)系數(shù)反應(yīng)出來(lái)，為 0.9997。精確度非常高，保證了樣品測(cè)定后將峰面積換算成濃度的過(guò)程不會(huì)造成很大誤差。（2）維生素C 必須快速處理，不然會(huì)由于維生素C 的分解或變質(zhì)導(dǎo)致吸收峰偏移：由本次實(shí)驗(yàn)分析過(guò)程可見(jiàn)：辣椒與番茄

13、樣品的維生素 C 峰面積比 5mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液維生素C峰面積還要小，由于樣品的數(shù)據(jù)并不性方程的區(qū)間內(nèi)，所以不能得到更精確的分析結(jié)果。其原因可能是辣椒與番茄樣品存放過(guò)久，部分維生素 C 被氧化或變質(zhì)，又或者是在攪拌與微波萃取過(guò)程中耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，同樣讓其變質(zhì)氧化。而對(duì)于蓮霧樣品的處理，實(shí)際配制出的蓮霧樣液帶有淺紫色，比其它樣品液的顏色都要深，所以可以蓮霧定性曲線中的最可能是由色素分子產(chǎn)生，但絕對(duì)不會(huì)是維生素 C。由曲線中可見(jiàn)，在停留時(shí)間為 2.624 與 2.848 分鐘時(shí)都產(chǎn)生了相近高度的峰，此時(shí)無(wú)法判斷維生素 C的位置?？梢圆扇〉姆椒椋合蜓b有蓮霧樣液的色譜小瓶中，用滴管滴入 1-2 滴非常稀

14、的維生素C 標(biāo)液，然后重新放入液相色譜儀中進(jìn)行分析。此時(shí)會(huì)發(fā)生兩個(gè)可能性：1.如果其中的任意一個(gè)峰高度得到提高，則說(shuō)明該峰就是維生素 C 的特征峰；2.如果在兩個(gè)原有的峰以外產(chǎn)生了新的色譜峰，則說(shuō)明新的峰才是維生素C，蓮霧樣品的處理有不當(dāng)，必須改變處理方法。但是由于同組的同學(xué)沒(méi)有聽(tīng)清指示，滴入了實(shí)驗(yàn)員原本配好的維生素 C 樣液，這樣的話新的維生素 C直接掩蓋掉原來(lái)的兩個(gè)色譜峰，此時(shí)也就無(wú)法判斷蓮霧樣品到底發(fā)生了什么問(wèn)題。3.2.2 思考題（1）校準(zhǔn)曲線有和優(yōu)缺點(diǎn)？液相色譜法中常用的定性定量方法有哪些？答：標(biāo)準(zhǔn)曲的優(yōu)點(diǎn)：數(shù)據(jù)處理直觀，避免了復(fù)雜計(jì)算帶來(lái)的不便，適用于大量樣品的分析；缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較

15、低，當(dāng)待測(cè)樣品成分比較復(fù)雜，基體干擾比較大的時(shí)候，很難找到合適的物質(zhì)來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)系列，而且由于每次的色譜條件不盡相同，容易有很大誤差。定性方法：利用保留時(shí)間定性分析，或者與結(jié)構(gòu)表征的檢測(cè)器聯(lián)用進(jìn)行定性分析；定量方法：利用峰高與峰面積定量分析，或者使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析（當(dāng)樣品不是真溶液）。（2）如何快速建立未知物的液相色譜方法？一般應(yīng)考慮哪些主要？答：高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液-固吸附色譜法、液-液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。一般高效液相色譜法的建立應(yīng)根據(jù)分析對(duì)象的性質(zhì)，考慮以下：（1） 色譜柱的選擇。色譜柱是液相色譜分析的組件，分為正相色譜

16、和反相色譜。正相色譜動(dòng)相極性小于固定相極性，極性小的先流出，因此正相色譜柱適于極性組分分離，如硅、羥基、 基等；反相色譜動(dòng)相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離，如烷基鍵合硅C8、C18 等。（2）相的選擇和處理。一個(gè)理想的液相色譜相溶劑應(yīng)該具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好，易于得到產(chǎn)品和低毒性，易于回收等特點(diǎn)；對(duì)于正相色譜，通常采用烷烴加適量極性調(diào)整劑；對(duì)于反相色譜，通常以水作基礎(chǔ)溶劑，再加入一定量能與水互溶的極性調(diào)整劑，如甲醇，乙腈與四氫呋喃。本實(shí)驗(yàn)中使用的乙腈可以滿足在紫外 185-205nm 的檢測(cè)要求，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高，粘度較小，所以比起甲醇-水系統(tǒng)更加優(yōu)越。另外溶劑

17、和樣品過(guò)濾非常重要，它會(huì)對(duì)色譜柱、儀器起到保護(hù)作用，所有溶劑使用前必須經(jīng)過(guò) 0.45m 的濾膜濾過(guò)，色譜純?cè)噭┮膊焕猓ǔ亲⒚鳌耙褳V過(guò)”）。相使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如 O2），防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)相由色譜至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無(wú)法分析。溶解的氧氣還會(huì)導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。（3）微波輔助萃取法為何能達(dá)到快速高效的萃取效果？答：微波是波長(zhǎng)在 1mm-1m 之間的電磁波，頻率在 300MHz-300000MHz 之間。在高頻微波能的作用下，樣品及溶液中的偶極分子迅速產(chǎn)生高頻率摩擦，

18、從而在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量熱量。偶極分子旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致弱的氫鍵斷裂、離子遷移等加速了溶劑分子對(duì)樣品基體的滲透，待分析成分很快溶劑化，微波萃取時(shí)間便顯著縮短了。與電加熱的熱傳導(dǎo)原理相比，熱損耗更小，效率更高。（4）試比較液相色譜法和氣相色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)？答：（1）分析對(duì)象及范圍：氣相色譜分析只限于氣體和低沸點(diǎn)的穩(wěn)定化合物；高效液相色譜可以分析高沸點(diǎn)、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的 80% ；（2）相的選擇：氣相色譜采用的相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對(duì)組分作用?。桓咝б合嗌V采用的相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會(huì)多。它除了起運(yùn)載作用外，重復(fù)性更好，定量準(zhǔn)確性更好，還可與組分作用，并與固定相對(duì)組分的作用產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，即相對(duì)分離的貢獻(xiàn)很大，可通過(guò)溶劑來(lái)控制和改進(jìn)分離；（3）操作