銀杏葉提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號(hào)TLR4表達(dá)的影響

1、銀杏葉提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織炎癥信號(hào)TLR4表達(dá)的影響【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物;腦梗死;大鼠;Tll樣受體4腦血管病是臨床常見(jiàn)并多發(fā)病之一，尤其腦梗死(I)具有較高的發(fā)生率、致殘率、病死率，I后缺血損傷的機(jī)制復(fù)雜，其中過(guò)度的炎癥免疫反響存在于I后壞死及缺血區(qū)域，導(dǎo)致炎性損傷，此已成共識(shí)，因此減輕炎癥損傷成為治療急性腦梗死(AI)的主要途徑之一，研究證實(shí)TLR4與非生物性炎性損傷關(guān)系親密1，2。銀杏葉味甘、苦、澀，性平，有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛成效，其主要有效成分銀杏葉提取物(GBE)已被廣泛應(yīng)用于腦血管疾膊3、認(rèn)知功能障礙4、炎癥5等相關(guān)疾病的治療，但其對(duì)I的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)觀察

2、銀杏葉提取物對(duì)I大鼠腦組織TLR4基因及蛋白表達(dá)的影響，討論銀杏葉提取物抗I的可能作用。1材料與方法1.2實(shí)驗(yàn)方法將60只大鼠隨機(jī)分為：假手術(shù)組，模型組和銀杏葉提取物組。每組又分為6、12、24和48h，4個(gè)亞組，每亞組均為5只大鼠。假手術(shù)組大鼠不插線，模型組及銀杏葉提取物組線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞的動(dòng)物模型。各組均為腹腔給藥，將藥物以蒸餾水制成一樣濃度混懸液(40g/l)，模型組及假手術(shù)組均給予1l生理鹽水，于手術(shù)完畢后3h給藥1次，之后每天1次，直至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取前囟前2至前囟后3腦組織，以進(jìn)針點(diǎn)為界分為前后兩局部，前局部取梗死灶周圍腦組織，快速稱取100g，置于冰浴中的勻

3、漿器并迅速勻漿，用于抽提總RNA。后局部腦組織用4%多聚甲醛固定液固定，4下持續(xù)固定2448h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，在切片機(jī)上連續(xù)冠狀切片，片厚5，-20保存。1.3.1梗死灶周圍腦組織總RNA抽提與純化在冰浴勻漿器中參加1lTrizl及100g組織，迅速研磨，將勻漿液裝于EP管中，參加200l氯仿劇烈震搖30s，間隔放冰盒保溫，反復(fù)震蕩，4，12000r/in，低溫離心20in，取上層水相轉(zhuǎn)移至另一EP管中，加等體積的異丙醇，輕輕混勻，-20過(guò)夜，4，12000r/in，低溫離心20in，棄上清，加75%乙醇700l輕輕混勻，4，12000r/in，低溫離心10in，輕輕吸出上清，

4、室溫垂直放置2030in涼干，參加DEP水20l溶解，留取1l待測(cè)RNA濃度。1.3.2逆轉(zhuǎn)錄(RT合成第1條鏈DNA)在PR管中建立如下反響體系：依次參加如下試劑：5RT緩沖液5l、dNTP(10l/L)2.5l、Rnasin1l、Prier1l、2LV1l，RNA及DEP水總共14.5l。短暫離心振蕩混勻4低溫短暫離心;在PR儀中，37反轉(zhuǎn)錄50in，955in滅活反轉(zhuǎn)錄酶，立即冰浴，-20保存。1.5免疫組化染色免疫組化染色采用SAB法，石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟，梯度酒精浸泡后充分水洗，置于3%H22/甲醛溶液中15in，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，浸入0.01l/L、pH6.0枸櫞酸鹽緩液中

5、，加熱至9298熱修復(fù)抗原，20in后冷卻至室溫，0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，正常山羊血清封閉液孵育30in。滴加兔抗鼠TLR4多克隆抗體(1400)，4孵育過(guò)夜。0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，37孵育45in。吸去二抗，0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次;參加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，37孵育30in。0.01lPBS(pH6.0)振洗5in3次，DAB顯色，適時(shí)終止反響;蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)均以xs表示，組間比擬運(yùn)用單因素方

6、差分析，兩兩比擬運(yùn)用q檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)用SAS軟件處理。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1各組腦組織TLR4RNA相對(duì)表達(dá)各組各時(shí)間點(diǎn)TLR4RNA均表達(dá)，與假手術(shù)組相比模型組各時(shí)間點(diǎn)TLR4RNA相對(duì)表達(dá)均明顯升高，且在24h達(dá)頂峰，持續(xù)到48h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);銀杏葉提取物組TLR4RNA相對(duì)表達(dá)明顯低于模型組(P0.01)，見(jiàn)表1，圖1。表1各組大鼠腦組織TLR4RNA相對(duì)表達(dá)程度的比擬1)與模型組比擬，2)與6，12h組比擬：均P0.01，下表同圖1各組大鼠腦組織TLR4RNA表達(dá)2.2各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(dá)假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)偶有TLR4少量表達(dá);TLR4表達(dá)以小膠質(zhì)細(xì)胞為主，位于細(xì)胞胞漿內(nèi)。模型組在觀察的時(shí)間段內(nèi)6、12、24及48hTLR4蛋白表達(dá)明顯增多，于缺血后24h達(dá)頂峰，持續(xù)大約48h。銀杏葉提取物組TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)明顯低于模型組(P0.01)，見(jiàn)表2。表2各組大鼠腦組織TLR4蛋白的表達(dá)3討論銀杏葉提取物抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用正逐漸受到重視。腦缺血損傷見(jiàn)于許多臨床病理過(guò)程，影響這一過(guò)程的因素是多方面的。一般認(rèn)為，腦缺血損傷是典型的非感染性炎癥損傷，