基因工程方法生產(chǎn)乙肝疫苗

1、 工 生 疫 ( 3 )-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company -CAL-本僅作為文檔封面，使用請(qǐng)直接刪除重組乙肝疫苗的研制生產(chǎn)過程、理化性質(zhì)、生物學(xué)活性、臨床應(yīng)用國際上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫 苗。第一代乙肝疫苗主要運(yùn)用乙肝病毒攜帶者血清中提取純化出的的乙肝病 毒表面抗原，先后經(jīng)過減毒處理和添加佐劑后注入人體預(yù)防接種。 是由于 對(duì)血源性疫苗安全性存在顧慮，人們進(jìn)一步著手開發(fā)第二代乙肝疫苗，也就 是基因重組疫苗。第一步是分離目的基因，獲得目的 DNA 片段的方法主要有兩 種，一是直接從細(xì)胞基因組中分離，二是人工合成。第二步是將 片段和載體在體外

2、連接重組，成為重組 分子， 多采用連接酶的方法連接。第三步是基因克隆，即將重組體 DNA 分子，引進(jìn)合適的宿主細(xì)胞(大 腸桿菌、酵母)中增殖。根據(jù)所用載體的不同，可選用轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒作載體 時(shí)，重組體 DNA 分子以此種方式進(jìn)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，以獲得轉(zhuǎn)化子菌 落)、轉(zhuǎn)染( 噬菌體作載體時(shí)，構(gòu)成的重組體 分子，以此種方式進(jìn)入宿 主細(xì)胞，可轉(zhuǎn)染得到噬菌斑)、轉(zhuǎn)導(dǎo)( 噬菌體 DNA 與外源 DNA 組成的重組體 DNA 分子，與噬菌體蛋白組裝成具有感染力的噬菌體顆粒，即人工包裝的噬 菌體顆粒，引入宿主細(xì)胞)的方法，往宿主細(xì)胞引入重組體 DNA 分子。第四步是目的基因克隆的篩選與鑒定，即從大量攜帶重組體

3、 DNA 分 子的細(xì)胞中分離出帶目的基因的細(xì)胞。因?yàn)椴皇撬械募?xì)胞都能獲得重組體 DNA 分子，為了獲得攝取了重組體 分子細(xì)胞，需經(jīng)篩選，才能將其與未 攝取重組體 DNA 分子的細(xì)胞區(qū)別開來，并作進(jìn)一步鑒定。篩選含有重組體 DNA 分子細(xì)胞的方法，一般都是以載體 及目的基因的遺傳標(biāo)記及分子特 征為依據(jù)，并結(jié)合受體細(xì)胞的基因表型而建立起來的。由于許多質(zhì)粒都具有 抗生素等藥物的抗性標(biāo)記，因此，在含有一定濃度抗生素的選擇培養(yǎng)基上， 可以很容易地把攝取了重組體 分子，因同時(shí)也獲得了抗生素抗性的細(xì)胞 辨認(rèn)出來。但藥物篩選只是一個(gè)方面，依據(jù)它只能判斷質(zhì)粒載體是否進(jìn)入了 受體細(xì)胞，還不能確定受體細(xì)胞是否攝取

4、了含有目的基因的重組體 分 子。對(duì)于重組體 分子的鑒別，通常是在抽提出重組質(zhì)粒 后，用 凝膠電泳法或電鏡觀察其分子大小，用限制酶酶解，觀察其酶切圖譜進(jìn)行。 還可采用菌落原位雜交法來進(jìn)行鑒定，即將菌落從最初生長(zhǎng)的平板上轉(zhuǎn)移到 硝酸纖維素濾膜上，用堿裂解濾膜上的菌落，使 分子游離，變性，并固 定在濾膜上，隨即用同位素標(biāo)記的與目的基因互補(bǔ)的 或 RNA 探針雜交， 最后通過濾膜的放射自顯影鑒定菌落，并從最初生長(zhǎng)的平皿上挑選出放射自 顯影呈陽性的菌落。第五步是基因表達(dá)，這是指宿主細(xì)胞在大量繁殖過程中外源 DNA 在 宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯，表達(dá)生成的產(chǎn)物(蛋白質(zhì))，最好在細(xì)胞內(nèi)不被分 解，而分泌到細(xì)胞

5、外面。表達(dá)產(chǎn)物若為較小的多肽，或是對(duì)細(xì)菌蛋白酶極為 敏感的蛋白質(zhì)，形成后，通常即被迅速降解。為了保證外源基因表達(dá)產(chǎn)物能 分泌到細(xì)胞外而不被降解，通?？梢园淹庠椿虿迦朐谳d體的某些結(jié)構(gòu)基因 中間，在這種情況下，表達(dá)產(chǎn)物是融合蛋白質(zhì)，融合蛋白質(zhì)可以抵抗內(nèi)源蛋 白酶的降解，又可以在細(xì)胞信號(hào)肽的引導(dǎo)下分泌到細(xì)胞外。最后，利用發(fā)酵工程培養(yǎng)重組與乙肝疫苗的工程菌理化性質(zhì)從熱穩(wěn)定性方面說酵母源乙型肝炎疫苗37保存1周不改變其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45個(gè)氨基酸的多肽，通過化學(xué)合成的方式制備， 使用直接注射的方法打入靜脈。這5個(gè)氨基酸分別編碼了三個(gè)抗原表位（所 謂表位，是一串大于9個(gè)氨基酸的多肽，是能夠刺

6、激免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)的最小 多肽片段）：,HBscFv 等電點(diǎn)理論值為 1,實(shí)驗(yàn)值為 （就是抗體）綜上所述，用基因工程法生產(chǎn)乙肝疫苗要先后將過獲取目的基因、構(gòu)建 重組質(zhì)粒、構(gòu)建基因工程菌、培養(yǎng)工程菌、乙肝病毒表面抗原的分離純化、 產(chǎn)品多項(xiàng)性質(zhì)的初步檢測(cè)、成品化處理（如添加佐劑、抗生素、除菌）、成 品檢測(cè)鑒定、包裝幾個(gè)步驟。對(duì)產(chǎn)品多項(xiàng)性質(zhì)的檢測(cè)對(duì)于保證疫苗的安全性 尤其重要。目 床上應(yīng)用的 肝疫苗主要有以下幾種： ) 源性乙肝疫苗： 此疫苗是用無癥狀的 HBsAg 攜帶者的血液制 成，故稱血源性乙肝疫苗。它的制備步驟大致是：采用高滴度 HBsAg 陽 性攜帶者血液，分離出血漿并除去其中有感染的 H

7、BV 顆粒后，再將 HBsAg 予以濃縮與純化，充分滅活，以消滅其中可能存在的一切已知病 毒和消除 HBsAg 表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐劑及防腐劑 而成。為確保疫苗的安全，每一階段均取樣做無菌試驗(yàn)、熱源試驗(yàn)及動(dòng) 物安全試驗(yàn)等，以檢查疫苗中有無其他病原體及血液中的抗原物質(zhì)。此 種疫苗的免疫原性與安全性均已獲得解決。 ) 因工程疫苗 利用基因工程研制重組 DNA 乙肝疫苗，曾先后 研制過大腸桿菌系統(tǒng)、啤酒酵母細(xì)胞系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)和牛痘病 毒系統(tǒng)的重組乙肝疫苗。目前多用酵母基因的重組疫苗。其具有良好的 免疫原性，免疫應(yīng)答特點(diǎn)與血源性乙肝疫苗基本相似，且多無嚴(yán)重的不 良反應(yīng)。(3

8、) 含前 蛋的乙肝疫苗 目前臨床上應(yīng)用的血源性疫苗與 基因工程疫苗，均只含 HBsAg 蛋白，當(dāng)證實(shí) S 白能增強(qiáng) HBsAg 的免疫 應(yīng)答后，又注意到單純只含 HBsAg 蛋白的疫苗對(duì)血液透析病人與新生兒 免疫效果較差時(shí)，遂生產(chǎn)出添加前 S 白的酵母源性重組乙肝疫苗，它 確能明顯地增強(qiáng)免疫應(yīng)答。圖 1 乙肝病毒表面蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程技術(shù)生產(chǎn)乙肝疫苗首先要選擇表達(dá) 的載體系統(tǒng)。在之前 的研究中發(fā)現(xiàn)，若選用細(xì)菌為基因表達(dá)載體，即使使用強(qiáng)啟動(dòng)子，也不能得 到大量具有免疫原性的基因表達(dá)產(chǎn)物?？赡苁怯捎谠吮磉_(dá)系統(tǒng)中不能進(jìn) 行糖基化修飾，或者原核細(xì)胞環(huán)境不適合專性寄生于真核生物的乙肝病毒包 膜蛋白表達(dá)，故應(yīng)選用真核表達(dá)系統(tǒng)。選用酵母（ cerevisiae）作為宿主系統(tǒng)，因其具有豐富的膜結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器的特點(diǎn)，既可 使蛋白以分泌形式表達(dá)，又可以使蛋白糖基化變?yōu)榛钚孕问??？寺≥d體構(gòu)建 時(shí)，將編碼 HBsAg 的基因