qPCR技術(shù)概述課件

1、RNA提取和熒光定量概述郵箱：電話：187102808402022/9/231目錄第一部分：RNA提取RNA的重要性RNA提取的方法RNA質(zhì)量的鑒定第二部分：熒光定量 熒光定量的原理和方法 熒光定量的應(yīng)用 市場(chǎng)上常見的熒光定量產(chǎn)品2022/9/2322022/9/233從RNA開始到基因拷貝數(shù)的定量或者表達(dá)研究，已經(jīng)成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)的主流設(shè)計(jì)方案，也是RNA相關(guān)課題研究的首選思路。完整RNA的提取和純化,是進(jìn)行RNA方面的研究工作,如Nothern雜交、RNA芯片，mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等的前提。1. RNA提取的重要性2022/9/2341. RNA提取

2、的重要性2. RNA提取方法2022/9/235細(xì)胞內(nèi)的大部分RNA是以核蛋白復(fù)合體的形式存在，所以在提取RNA時(shí)要利用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑（ SDS、胍鹽等),迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制RNA酶的活性，使核蛋白與RNA分離，釋放出RNA。 通過(guò)有機(jī)溶劑（酚、氯仿 等）處理可以使RNA與其他細(xì)胞組分分離，得到純化的總RNA。2. RNA提取方法樣品準(zhǔn)備2022/9/237樣本最好用新鮮或者速凍(不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70冰箱中)的沒有經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融的樣本。樣品預(yù)處理方式：不同來(lái)源的樣品（如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、植物組織、細(xì)胞等）因細(xì)胞結(jié)果不同預(yù)處理方式亦有所不同。一般處理方式如下： 植

3、物材料液氮研磨 動(dòng)物材料勻漿(液氮條件下)、液氮研磨 細(xì)菌溶菌酶破壁2. RNA提取方法細(xì)胞裂解異硫氰酸胍/苯酚法（TRIzol法）:TRIzol方法，Invitrogen公司最先開發(fā)，應(yīng)用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)次生代謝較多的植物材料，RNA提取效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離，并將RNA釋放到溶液中。而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)。2022/9/238基因組DNA水相有機(jī)相RNA2. RNA提取方法細(xì)胞裂解2022/9/2310其他方法：有些植

4、物材料多糖多酚，如植物果實(shí)，番茄葉子等；有些植物木質(zhì)化程度較高，如根莖等組織，這些都會(huì)導(dǎo)致RNA提取過(guò)程的困難。如：纖維組織（心臟，骨骼肌等）由于這些組織細(xì)胞密度低，單位重量組織中RNA含量低，所以需要增加起始量。蛋白/脂肪含量高的組織（腦，油菜，菜籽等）如果抽提后上清含白色絮狀物，需要重新抽提。2. RNA提取方法純化2022/9/2311純化原則：消除RNA樣品中存在的對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄 酶）有抑制效應(yīng)的有機(jī)溶劑和高亮度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖、脂類分子的污染。排除DNA分子的污染2. RNA提取方法純化有機(jī)溶劑抽提法抽提：常用氯仿，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)沉淀：用異丙醇或乙

5、醇來(lái)沉淀水相中的RNA洗滌：75%的乙醇洗滌，去除鹽離子溶解：加入適量的RNase-free ddH2O2022/9/23123.RNA評(píng)價(jià)與鑒定 提取RNA后我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)， 以確定它是否符合后續(xù)試驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)試驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同。如：cDNA文庫(kù)構(gòu)建：要求RNA完整，且無(wú)酶抑制物殘留Northern blot ：對(duì)RNA的完整性要求高RT-PCR:對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格2022/9/23143.RNA評(píng)價(jià)與鑒定RNA純度檢測(cè)分光光度計(jì)法通過(guò)OD260/280來(lái)檢測(cè)RNA的純度，OD260/230作為參考OD260/280在1.9-2.1之間，

6、可以認(rèn)為RNA的純度較好；OD260/280小于1.8，則表明蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多；OD260/280大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；OD260/230小于2.0，表明裂解液中有異硫氰酸胍和-疏基乙醇的殘留。2022/9/2315第二部分：實(shí)時(shí)熒光定量PCR2022/9/2317在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和CT值對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 1.qPCR原理和方法2022/9/2318實(shí)時(shí)熒光定量PCR是1996年由Applied Biosysrems 公司推出的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；常用的熒光標(biāo)記方法：1，非特異性熒光標(biāo)記（染料法）： 1、SY

7、BR Green 2、EvaGreen 3、LC Green2，特異性熒光標(biāo)記（探針法）： 1、TaqMan 2、Molecular Beacon 3、Amplisensor1.qPCR原理和方法SYBRB Green基本原理: SYBR Green I是一種結(jié)合于所有DNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光，當(dāng)DNA雙鏈分開，無(wú)熒光。 2022/9/2319SYBR GreenSYBR GREEN法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA模板沒有選擇性-適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏 便宜缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性（但可以通過(guò)溶解曲線的

8、分析優(yōu)化反應(yīng)條件）對(duì)引物特異性要求較高2022/9/23201.qPCR原理和方法SYBRB Green1.qPCR原理和方法SYBR Green熔解曲線分析利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點(diǎn)的性質(zhì)，通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析可以識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增。2022/9/2321SYBR GREEN 熔解曲線分析將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求導(dǎo)。(-dI/dT)融解曲線分析，單一峰無(wú)非特異性熒光定量準(zhǔn)確1.qPCR原理和方法SYBR Green 熔解曲線分析2022/9/23221，融解曲線分析，有雜峰；2，其他產(chǎn)物出現(xiàn)非特異性熒光，因此定量不準(zhǔn)確。1.qPCR原理和方法Taq ma

9、n探針法2022/9/23241.qPCR原理和方法Taq man探針法2022/9/2325Taq man探針法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)序列高特異性-陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單-與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高不容易找到本底低的探針1.qPCR原理和方法Taq man探針法2022/9/2327Taq man探針法優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)序列高特異性 檢測(cè)SNP最靈敏的試劑之一。熒光背景低缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo)價(jià)格較高不容易找到本底低的探針2.qPCR原理和方法 定量原理2022/9/23282.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2329Fluores c

10、ence2.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2330Ct值的定義：CT值： C代表Cycle，T代表閾值(threshold)，CT值的含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。CT值由閾值確定2.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2331閾值(threshold) 缺省值設(shè)定為基線（baseline，即本底信號(hào)）范圍(3-15個(gè)循環(huán))內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。閥值由基線確定2.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2332理想的PCR反應(yīng): XnX0 * 2nXn ：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n ：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)2.qPCR原理和方法定

11、量原理2022/9/2333非理想的PCR反應(yīng): XnX0 * (1+En)n Xn：第n次循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量X0 ：起始模板數(shù)量n： 擴(kuò)增循環(huán)數(shù)En: 擴(kuò)增效率2.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2334在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0(1+Ex)Ct=M - (1)XCt：熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: lg M=lg X0(1+Ex)*Ct-(2)整理方程式(2)得: lg X0= -Ctlg(1+Ex) + lg M- (3)擴(kuò)增產(chǎn)物的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就

12、可計(jì)算出樣品中所含的模板量。2.qPCR原理和方法定量原理2022/9/2335熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對(duì)數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210濃度的對(duì)數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計(jì)算出樣品中所含的模板量2.qPCR原理和方法定量原理絕對(duì)定量 目的是測(cè)定未知樣品的準(zhǔn)確拷貝數(shù)或濃度，需要已知準(zhǔn)確拷貝數(shù)或濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)處理比較方便，容易理解。相對(duì)定量 不需要測(cè)定未知樣品的準(zhǔn)確拷貝數(shù)或濃度，只需要知道樣品之間的濃度比值。所以，標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知準(zhǔn)確拷貝數(shù)或濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，但是，最常用的方法是通過(guò)稀釋目的基因的PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)

13、品；標(biāo)準(zhǔn)品可有可無(wú)。數(shù)據(jù)處理相對(duì)復(fù)雜，比較難理解。2022/9/2336絕對(duì)定量2022/9/2337敏感性高: 檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品;區(qū)分小差異樣品大范圍拷貝數(shù)樣品同時(shí)檢測(cè): 100 1010省時(shí)有效臨床檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)環(huán)境監(jiān)測(cè)等標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量舉例2022/9/2338標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量舉例2022/9/2339設(shè)置內(nèi)標(biāo)：b-actin、GAPDH等管家基因?qū)Π谢蜻M(jìn)行均一化：靶基因拷貝每一個(gè)內(nèi)標(biāo)基因拷貝 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法 含靶基因與含內(nèi)標(biāo)基因的濃度梯度質(zhì)粒分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線； 樣本靶基因與內(nèi)標(biāo)基因絕對(duì)濃度的換算，并均一化處理， 標(biāo)本間靶基因的表達(dá)水平分析 2 -c(t) 法 標(biāo)本內(nèi)靶基因與內(nèi)標(biāo)基因Ct值比較： C(t) =C(t)m- C(t)n 標(biāo)本間C(t) 比較： c(t) C(t)1-C(t) 2 -c(t) 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量舉例2022/9/2340標(biāo)準(zhǔn)曲線法相對(duì)定量舉例2022/9/23413. qPCR的應(yīng)用1，定量分析2，定性分析2022/9/23423.qPCR的應(yīng)用定量分析絕對(duì)定量分析：DNA 或 RNA 的絕對(duì)定量分析 病原微生物或病毒含量的檢測(cè) ,轉(zhuǎn)基因動(dòng)植拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等。 相對(duì)定量