基因組DNA的提取與分離鑒定課后研討題

1、基因組DNA的提取與別離鑒定課后研討題1、動(dòng)植物DNA提取的方法主要有哪些？并說(shuō)明各方法的原理。答：.濃鹽法利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者別離，常用的方法是用1M氯納提取化 鈉抽提,得到的DNP粘液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩，使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí) 蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中，用2倍體積95與乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來(lái).也可用0. 15 MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以IMNaCL提取脫氧核糖蛋白，再按氯 仿一一異醇法除去蛋白.兩種方法比擬,后種方法使核酸降解可能少一些.以稀鹽酸溶液提取DNA時(shí)，加入適量去污劑，如SDS

2、可有助蛋白質(zhì)與DNA的別離。在提取 過(guò)程中為抑制組織中的DNase對(duì)DNA的降解作用，在氯化鈉溶液中加入檸檬酸鈉作為金屬離 子的烙合劑.通常用.15MNaCL, 0. 015M檸檬鈉，并稱SSC溶液,提取DNA.陰離子去污劑法：用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中提取DNA .由于細(xì)胞中 DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，因?yàn)殛庪x子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以 常用陰離子去污劑提取DNA.苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑，同時(shí)抑制了 DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí)，由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子外表又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶

3、于酚相，而DMA 溶于水相。離心分層后取出水層，屢次重復(fù)操作，再合并含DNA的水相，利用核酸不溶于 醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA。此時(shí)DNA是十分粘稠的物質(zhì)，可用玻璃漫漫繞成一團(tuán)，取出。 此法的特點(diǎn)是使提取的DNA保持天然狀態(tài).水抽提法：利用核酸溶解于水的性質(zhì),將組織細(xì)胞破碎后,用低鹽溶液除去RNA,然后將沉淀溶于水中， 使DNA充分溶解于水中，離心后收集上清液.在上清中加入固體氯化鈉調(diào)節(jié)至2. 6M,加入2倍 體積95%乙醉,立即用攪拌法攪出.然后分別用66%,80%和95%乙醉以及丙銅洗滌,最后在空 氣中干燥，既得DNA樣品.此法提取的DNA中蛋白質(zhì)含量較高，故一般不用.為除蛋白可將此法 加

4、以改良，在提取過(guò)程中加入SDS.2、苯酚、氯仿和異戊醇在基因組DNA的提取中各有什么作用？答：苯酚：使蛋白質(zhì)變性，同時(shí)抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)，由 于蛋白與DNA聯(lián)結(jié)鍵己斷，蛋白分子外表又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子 溶于酚相，而DNA溶于水相。氯仿：氯仿的作用有多個(gè)方面，一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白，使其沉淀并通過(guò)離心除 去，同時(shí)也通過(guò)變性作用抑制RNase活性；二是RNA提取試劑中通常含有苯酚，苯酚微溶于 水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會(huì)損傷核酸，需要通過(guò)氯仿把水相里參與的 苯酚抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比方油脂、脂溶性色素

5、等），起 到一定除雜作用異戊醇：減少蛋白質(zhì)變性操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。異戊醇可以降低外表張力，從而減 少氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相 及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。3、無(wú)水乙醇沉淀DNA的原理是什么？答：用無(wú)水乙醇沉淀DMA,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比 和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反響，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。DNA 溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿?，使DNA 失水而易于聚合。4、結(jié)合本人實(shí)驗(yàn)操作的體會(huì)，試述在提取過(guò)程中應(yīng)如何防止大分子DNA的降解和斷裂？

6、答：（1）控制好溫度，保持溫度在適宜范圍內(nèi)，因?yàn)槎虝r(shí)高溫主要是造成DNA的變性，也就 是DNA雙鏈解鏈成為單鏈，但在溫度下降后會(huì)恢復(fù)為雙鏈形式。DNA在溶液尤其是水的稀溶 液中，會(huì)發(fā)生自然的降解作用。降解作用速率和溫度關(guān)系不大，但是反復(fù)的凍融會(huì)加速DNA 的斷裂和降解。（2）操作過(guò)程必須全程溫和進(jìn)行，假設(shè)劇烈震蕩，轉(zhuǎn)移DNA的搶頭沒(méi)有剪去尖部，擴(kuò)寬管口， 吸取過(guò)程產(chǎn)生汽泡，用了反復(fù)吸打的的方法助溶DNA沉淀都可能導(dǎo)致DNA斷裂。（3）為防止DNase的降解作用,器具盡可能滅菌,加EDTA。PH最好是在8. 05、DNA含量的測(cè)定方法有哪些？并說(shuō)明各方法的原理。6、如何判斷所提取樣品DNA (RNA)的純度？7、總結(jié)DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和考前須知。8、DNA瓊脂糖凝膠電泳