實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全

1、實(shí)驗(yàn)室規(guī)則與安全余 蔚1微生物危害程度分級(jí)食品中可能存在的微生物分類危害程度菌落總數(shù)，大腸菌群和糞大腸菌群I級(jí)低個(gè)體危害，低群體危害；常見(jiàn)食源性致病菌（沙門，志賀，金葡，單核細(xì)胞增生李氏菌等）II級(jí)中等個(gè)體危害，有限群體危害肉毒羧菌（發(fā)酵制品，肉制品），炭疽芽孢桿菌（肉類）等III級(jí)高個(gè)體危害，低群體危害鼠疫耶爾森氏菌（畜肉），埃爾托生物型霍亂弧菌（海產(chǎn)品，各類食品）等IV級(jí)高個(gè)體，高群體危害2022/9/252實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)水平BSL（Biosafety Level）分為：I，II，III，IV級(jí)，分別以BSL-1，BSL-2，BSL-3，BSL-4表示實(shí)驗(yàn)室的生物安全防護(hù)水平生物安全實(shí)

2、驗(yàn)室分級(jí)2022/9/253生物安全實(shí)驗(yàn)室的選擇II級(jí)危害常見(jiàn)致病菌的檢測(cè)，生化鑒定，免疫實(shí)驗(yàn)，PCR提取，涂片，顯微觀察等均需在BSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2022/9/254實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)屏障一級(jí)屏障主要包括：各級(jí)生物安全柜（用于防護(hù)可能生成的含有病原微生物的氣溶膠）和個(gè)人防護(hù)裝備二級(jí)屏障主要包括：建筑結(jié)構(gòu)，通風(fēng)空調(diào)，給水排水，電氣和控制系統(tǒng)2022/9/255生物安全實(shí)驗(yàn)室的硬件要求 BSL-2（基礎(chǔ)生物實(shí)驗(yàn)室 ）可共用建筑物，但應(yīng)有可自動(dòng)關(guān)閉帶鎖的門，實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)有可視窗應(yīng)采用窗戶進(jìn)行自然通風(fēng)，并應(yīng)帶有防蟲(chóng)紗窗。應(yīng)配備有生物安全柜，生物安全柜的作用是防護(hù)生成的含有病原生物的氣溶膠實(shí)驗(yàn)室門

3、上應(yīng)標(biāo)有國(guó)際通用的生物危害警告標(biāo)志。空氣流向：緩沖區(qū)-低污染區(qū)-嚴(yán)重污染區(qū)，每個(gè)區(qū)之間有-10-60pa的壓差，防止空氣倒流2022/9/2562022/9/257生物安全柜（BSCs）分級(jí)2022/9/258不同保護(hù)類型及生物安全柜的選擇2022/9/259無(wú)菌室的硬件要求墻面及地面應(yīng)光滑，易于清潔與消毒入口處應(yīng)設(shè)有緩沖間，緩沖間應(yīng)有紫外燈消毒，并有自動(dòng)洗手和干手裝置推薦溫度為20，濕度為40%-60%應(yīng)配備消毒裝置：紫外燈等2022/9/2510微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入規(guī)范只有經(jīng)批準(zhǔn)的人員方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域。實(shí)驗(yàn)室的門應(yīng)保持關(guān)閉。兒童以及與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的動(dòng)物不應(yīng)被批準(zhǔn)或允許進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域。20

4、22/9/2511無(wú)菌室的準(zhǔn)備與進(jìn)入無(wú)菌室使用前必須打開(kāi)無(wú)菌室的紫外燈輻照滅菌30分鐘以上，并且同時(shí)打開(kāi)超凈臺(tái)進(jìn)行吹風(fēng) 。進(jìn)入無(wú)菌室前30分鐘應(yīng)關(guān)閉紫外燈，以減少紫外線及臭氧對(duì)人體的傷害。進(jìn)入程序：肥皂（消毒液）洗手換無(wú)菌室工作鞋進(jìn)入緩沖間更換無(wú)菌室工作服，帶口罩，帽子2022/9/2512人員防護(hù)在實(shí)驗(yàn)室工作中，任何時(shí)候都必須穿著工作服。在進(jìn)行可能接觸到感染性材料的操作時(shí)，必須戴手套，手套使用完畢，應(yīng)先對(duì)手套進(jìn)行消毒再摘除手套，隨后必須洗手。在處理完感染性材料或離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室之前，都必須先洗手。嚴(yán)禁穿著實(shí)驗(yàn)室工作服離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室。禁止在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域進(jìn)食，飲水，化妝，戴隱性眼睛。禁止在實(shí)驗(yàn)室工作區(qū)域

5、儲(chǔ)存食物和飲料。實(shí)驗(yàn)室工作服和日常服裝必須分開(kāi)放置。2022/9/2513無(wú)菌室工作結(jié)束后的處理收拾操作臺(tái)面的廢棄物，用容器從傳遞窗傳出。噴75%酒精（消毒液）消毒操作臺(tái)面，離開(kāi)。進(jìn)入緩沖間，脫下工作服，口罩，帽子（一次性口罩，帽子應(yīng)帶出丟棄），換鞋2022/9/2514廢棄物的處理程序?qū)嶒?yàn)室應(yīng)配備有普通廢棄物和污染廢棄物兩個(gè)垃圾箱，在污染廢棄物垃圾箱上應(yīng)有生物危害標(biāo)志。廢棄物應(yīng)分類收集：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物及其污染物應(yīng)放入污染廢棄物垃圾箱內(nèi)。廢棄物的處理與消毒：121，30分鐘或以上高壓蒸汽滅菌，消毒液滅菌，或者高溫滅菌。任何必要的清洗，修復(fù)必須在滅菌或消毒處理之后進(jìn)行2022/9/2515實(shí)驗(yàn)室的

6、污染清除程序無(wú)菌室：紫外燈消毒：30min（室內(nèi)溫度20，濕度40%-60%）；30min（室內(nèi)溫度40,濕度60%）臭氧消毒：20mg/m3濃度的臭氧消毒時(shí)間30min消毒驗(yàn)證：平板計(jì)數(shù)瓊脂平板開(kāi)蓋暴露15min后，轉(zhuǎn)移至36培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)，要求15cfu2022/9/2516實(shí)驗(yàn)室的污染清除程序?qū)嶒?yàn)室廢棄物：高壓蒸汽滅菌是清除污染的首選方法。實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物，感染材料等應(yīng)先通過(guò)高壓蒸汽滅菌（121，30min或以上）處理其他消毒方法：消毒液（70%乙醇，有效氯濃度1g/mL的漂白劑，100mL/L的甲醇等）浸泡，高溫消毒等2022/9/2517實(shí)驗(yàn)室的污染清除程序生物安全柜：多聚甲醛（空氣

7、中濃度達(dá)到0.8%）熏蒸6h，比多聚甲醛濃度高10%的碳酸氫銨蒸發(fā)后，接通生物安全柜電源，啟動(dòng)2s，使碳酸氫銨循環(huán)2022/9/2518實(shí)驗(yàn)室的污染清除程序手部污染：大部分情況下，用普通的肥皂和水徹底沖洗手部即可清除手部污染，在高度危險(xiǎn)的情況下，建議使用殺菌肥皂。手要完全抹上肥皂，搓洗至少10s，用干凈水沖洗后再用干凈毛巾或紙巾擦干。沒(méi)有條件徹底洗手或洗手不方便，應(yīng)用70%酒精來(lái)清除手部的輕度污染。2022/9/2519安全應(yīng)急程序刺傷，切割傷或擦傷：脫下防護(hù)服，用肥皂和大量流水沖洗受傷部位，應(yīng)盡可能擠出傷口處的血液，70%酒精或其他消毒劑消毒傷口，必要時(shí)進(jìn)行醫(yī)學(xué)處理。潛在危害性氣溶膠的釋放（

8、生物安全柜外）：所有人員立即撤離，任何暴露人員都應(yīng)進(jìn)行醫(yī)學(xué)咨詢，在一定時(shí)間內(nèi)嚴(yán)禁人員進(jìn)入，應(yīng)在門口張貼“嚴(yán)禁進(jìn)入”的標(biāo)志。過(guò)了相應(yīng)的時(shí)間后，應(yīng)在生物專家的指導(dǎo)下清除污染才可以正常使用。2022/9/2520安全應(yīng)急程序容器破碎及感染性物質(zhì)溢出：應(yīng)立即用紙巾或者毛巾覆蓋在污染物上，隨后在其上倒消毒劑，作用30min后，清理掉布，紙巾及破碎物品，破碎玻璃應(yīng)用鑷子處理，處理用的紙巾，毛巾及破碎物品應(yīng)放入污染廢棄物垃圾箱中，經(jīng)過(guò)消毒處理后再丟棄。所有的操作過(guò)程都應(yīng)戴手套處理。2022/9/2521分子生物實(shí)驗(yàn)室硬件要求基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室分隔的工作區(qū)：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)，PCR擴(kuò)增區(qū)，擴(kuò)增

9、產(chǎn)物分析區(qū)。工作區(qū)工作服，試劑，儀器等必須有明確的標(biāo)記，避免混用。各實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有專用的儀器設(shè)備，同一區(qū)域內(nèi)的儀器設(shè)備、物品和工作服應(yīng)有明顯標(biāo)記，避免與其他區(qū)域的儀器設(shè)備混用。儀器設(shè)備的校準(zhǔn)應(yīng)符合ISO/IEC 17025：1999中5.5的規(guī)定。2022/9/2522PCR產(chǎn)物分析區(qū)本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來(lái)源，應(yīng)采用負(fù)壓條件或減壓（如排風(fēng)扇等）條件以減少擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散到其他區(qū)域。2022/9/2523基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入規(guī)范單一方向進(jìn)入：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。不同區(qū)域使用不同顏色工作服，工作服不得帶出所在工作區(qū)域送檢樣品的包裝應(yīng)完好并有明確的標(biāo)識(shí)；

10、在對(duì)實(shí)驗(yàn)室樣品進(jìn)行混樣、測(cè)試樣品的制備和稱量過(guò)程中應(yīng)避免交叉污染2022/9/2524實(shí)驗(yàn)室的污染清除程序?qū)嶒?yàn)室空間應(yīng)定期進(jìn)行紫外照射。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面：10%次氯酸鈉或3%雙氧水清潔臺(tái)面實(shí)驗(yàn)后紫外燈照射實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，照射過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)室的清潔程序應(yīng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)樣品粉碎區(qū)和準(zhǔn)備區(qū)PCR擴(kuò)增區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向清潔。含PCR產(chǎn)物的任何廢液，或污染了PCR產(chǎn)物的吸頭等試驗(yàn)用具，應(yīng)浸泡于1mol/L的鹽酸溶液，清除污染后丟棄。2022/9/2525個(gè)人防護(hù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中要穿實(shí)驗(yàn)服，戴手套。紫外線：應(yīng)佩戴具有紫外線防護(hù)功能的護(hù)目鏡和/或防護(hù)面罩，并遮蔽暴露的皮膚。2022/9/2526實(shí)驗(yàn)試劑和危害廢棄物

11、管理具有毒性，放射性，致癌或致突變性的試劑應(yīng)有明顯的標(biāo)志使用過(guò)的移液器吸頭應(yīng)放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于24 h。含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物應(yīng)放入含有1 mol/L HCl的容器中浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于6 h；采用PCR-ELISA方法檢測(cè)時(shí)洗板機(jī)洗板所產(chǎn)生的廢液應(yīng)收集至1 mol/L HCl溶液中。對(duì)含有EB或經(jīng)EB浸泡過(guò)的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理:KMnO4-NaOH（高濃度），活性炭過(guò)濾（低濃度）。陽(yáng)性質(zhì)粒宜放入1 mol/L HCl溶液中浸泡，浸泡時(shí)間不宜少于6 h。2022/9/2527微生物檢驗(yàn)原理2022/9/2528菌落總數(shù)食品檢樣經(jīng)過(guò)處理

12、，在一定條件下（培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基成分等）培養(yǎng)后，所形成的菌落數(shù)。所得到的是嗜中溫，需氧或兼性厭氧菌。單位：CFU（Colony Forming Units）檢驗(yàn)原理：36平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)2d2022/9/2529大腸菌群大腸菌群，在36培養(yǎng)2d，能產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧的G-無(wú)芽孢桿菌MPN最近似值檢測(cè)原理：LST肉湯初發(fā)酵，BGLB肉湯驗(yàn)證2022/9/2530霉菌和酵母在孟加拉紅培養(yǎng)基上，36培養(yǎng)5d，觀察結(jié)果霉菌菌落特征：菌落大、疏松、干燥、不透明，有的呈絨毛狀或絮狀或網(wǎng)狀等，菌體可沿培養(yǎng)基表面蔓延生長(zhǎng)，呈現(xiàn)紅、黃、綠、青綠、青灰、黑、白、灰等多種顏色。酵母菌落特征：菌落大而

13、厚，圓形，光滑濕潤(rùn)，粘性，顏色單調(diào)。常見(jiàn)白色、土黃色、紅色。2022/9/25312022/9/2532沙門氏菌檢驗(yàn)原理：前增菌：食品中沙門氏菌含量較少，且常由于食品加工過(guò)程使其受到損傷而處于瀕死狀態(tài)，所以對(duì)某些加工食品必須經(jīng)過(guò)前增菌處理，使其恢復(fù)活力，生雞蛋和肉類可省略此步驟選擇性增菌：沙門增殖，其他大多數(shù)細(xì)菌收到抑制。生化鑒定：借助于三糖鐵、靛基質(zhì)、尿素、KCN、賴氨酸等試驗(yàn)可與腸道其他菌屬相鑒別。血清學(xué)鑒定：通過(guò)菌種特殊的抗原結(jié)構(gòu)（O抗原為主），可以把他們分辨出來(lái)。步驟：復(fù)活（前增菌）培養(yǎng)（選擇性增菌）分離（平板劃線分離培養(yǎng)）鑒定（生化鑒定/血清鑒定）2022/9/2533金黃色葡萄球菌

14、檢驗(yàn)原理7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨蛋白肉湯：金葡耐鹽性強(qiáng)適宜生長(zhǎng)鹽濃度為5%7.5%，10%15%能生長(zhǎng) 血平板：金葡可產(chǎn)生溶血素，血平板上生長(zhǎng)菌落周圍有溶血環(huán)。 BP平板，Baird-Parker平板：金葡可產(chǎn)生卵磷脂酶，分解卵磷脂，產(chǎn)生甘油酯和可溶性磷酸膽鹽，所以在BP平板上生長(zhǎng)菌落為黑色，周圍有渾濁帶，外層有一透明圈。 金黃色葡萄球菌：黑色菌落，有暈圈和透明環(huán) 表皮葡萄球菌：黑色菌落 奇異變形桿菌：褐色菌落 大腸艾希氏菌：被抑制 血凝固酶試驗(yàn)：金葡菌可產(chǎn)生血漿凝固酶，可令血漿中的血漿蛋白酶原變成血漿蛋白酶，使血漿凝固，這是鑒定致病性金葡的重要指標(biāo)。步驟：前處理增菌分離鏡檢生化

15、鑒定2022/9/2534志賀氏菌實(shí)驗(yàn)原理樣品在GN增菌液中增菌68h后，HE或SS及麥康凱或EMB選擇性平板進(jìn)行分離，三糖鐵初步生化試驗(yàn)，半固體培養(yǎng)基動(dòng)力試驗(yàn)，如三糖鐵上：斜面陰性，底層陽(yáng)性，不產(chǎn)氣，硫化氫陰性，無(wú)動(dòng)力，可疑為志賀氏菌。步驟：增菌分離培養(yǎng)生化鑒定血清學(xué)鑒定2022/9/2535分子生物學(xué)方法在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用PCR方法：有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结?lè)ㄒ话阋残枰鼍?，然后加探針試劑雜交，然后在熒光顯微鏡熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)PCR方法對(duì)待測(cè)微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過(guò)凝膠電泳或熒光PCR技

16、術(shù)判斷結(jié)果。2022/9/2536分子生物學(xué)方法病原菌檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)分子生物學(xué)方法檢測(cè)致病菌，特異性較強(qiáng)，技術(shù)較為前沿，特別是相對(duì)國(guó)標(biāo)方面來(lái)說(shuō)。但國(guó)外用戶反映其假陽(yáng)性概率仍然較高，因此只能作為一種初篩方法。速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出結(jié)果，與免疫法比沒(méi)有速度優(yōu)勢(shì)目前不少產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)AOAC的認(rèn)證。2022/9/2537DNA 探針技術(shù)DNA 探針技術(shù)又稱分子雜交技術(shù), 是利用DNA分子的變性、復(fù)性以及堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度精確性, 對(duì)某一特異性DNA 序列進(jìn)行探查的新技術(shù)。DNA 探針是利用同位素、生物素等標(biāo)記的特定DNA 片斷, 該片斷可大至寄生蟲(chóng)基因組DNA, 小至20 個(gè)堿基。當(dāng)

17、DNA探針與待測(cè)的非標(biāo)記單鏈DNA( 或RNA) 按堿基順序互補(bǔ)結(jié)合時(shí), 以氫健將2 條單鏈連接而形成標(biāo)記DNA- DNA( 或標(biāo)記DNA- RNA) 的雙鏈雜交分子。將未配對(duì)結(jié)合的核苷酸溶解后用檢測(cè)系統(tǒng)( 放射自顯影或酶檢測(cè)等) 檢測(cè)雜交反應(yīng)結(jié)果。由于DNA 分子堿基互補(bǔ)的精確性, 單鏈DNA 探針僅與樣品中變性處理的DNA 單鏈出現(xiàn)配對(duì)雜交, 由此決定了探針的特異性;用放射性同位素( 如32P) 或生物素標(biāo)記探針, 使雜交試驗(yàn)同時(shí)具有高度的敏感性。2022/9/2538多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCRPCR 的基本原理是在體外對(duì)特定的雙鏈DNA 片斷進(jìn)行高效擴(kuò)增, 故又稱基因體外擴(kuò)增法。首先將靶DNA

18、 雙鏈加熱變性為單鏈, 然后加入兩段人工合成的與靶DNA 兩端互補(bǔ)的寡核苷酸片斷作為引物, 即左端引物和右端引物。該對(duì)引物與互補(bǔ)的DNA 單鏈堿基互補(bǔ)結(jié)合后, 在有DNA 聚合酶和4 種dNTPs 底物存在的情況下, 引物沿模板DNA 鏈按5- 3方向延伸, 自動(dòng)合成新的DNA 雙鏈。新合成的DNA 雙鏈又可作為擴(kuò)增的模板, 繼續(xù)重復(fù)以上的DNA 多聚酶鏈反應(yīng)。經(jīng)過(guò)2535 次循環(huán), 可將靶DNA 序列擴(kuò)增近百萬(wàn)倍。PCR技術(shù)有快速、特、敏感等特點(diǎn), 因而該技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用潛力。2022/9/2539基因芯片技術(shù)基因芯片技術(shù)是上個(gè)世紀(jì)末誕生的一項(xiàng)新型生物技術(shù)。它是將各種基因寡核苷酸點(diǎn)樣于芯片表面,微生物樣品DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后制備熒光標(biāo)記探針, 然后再與芯片上寡核苷