分子克隆實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、分子克隆實(shí)驗(yàn)報(bào)告-圖文分子克隆實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)： 分子克隆、分子雜交、基因表達(dá)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)類(lèi)型：綜合性指導(dǎo)教師：李一博班級(jí)：A 姓名：孫陽(yáng)陽(yáng) 學(xué)號(hào)：2021304100 實(shí)驗(yàn)時(shí)間： 2021/8/192021/8/25實(shí)驗(yàn)一 分子克隆DNA重組技術(shù)包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段 的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選 和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術(shù)是分子操作的核心部分實(shí)驗(yàn)原理及方法DNA 提取：（CTAB 法）CTAB是一種非離子去污劑，植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合 65?C水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來(lái)。CTAB與核 酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物

2、在髙鹽（0.7mM ）濃度下可溶，并穩(wěn)定 存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因 溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液 中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用70 75%酒精浸泡可 洗脫掉CTAB。再經(jīng)過(guò)氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質(zhì)、多 糖、色素等來(lái)純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等DNA沉淀劑將DNA 沉淀分離出來(lái)。感受態(tài)細(xì)胞的制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提?。涸趐H 12.0 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌大分子量染 色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓 撲纏繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有髙鹽存在及低溫的條件下，大

3、部 分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形 成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分 細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然 后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNACaCl2法：利用冰冷的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，可以誘 導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。106107轉(zhuǎn) 化子/?g DNA。酶切酶連：限制性?xún)?nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割DNA產(chǎn)生粘 性末端或平末端的外源片段，經(jīng)純化處理后的DNA用于連接反 應(yīng)；選擇克隆載體pUC19多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶切 割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作

4、用下將外 源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段的克隆。實(shí)驗(yàn)材料和試劑攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液；攜帶含有水稻DNA片段的M812載體的大腸桿菌菌液；氨芐 青霉素、卡那霉素；RNaseA；堿裂解法試劑Solution I:Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA10 mMRNase A100 ug/mlSolution II:NaOH0.2 MSDS1 %Solution III:KAC1.32 MUsing HAC to adjust pH to 4.8TE （pH 8.0）： Tris.HCl （pH 8.0）10 mMEDTA（pH 8.0）1 mM 苯酚/氯仿、無(wú)水乙醇

5、或異丙醇主要實(shí)驗(yàn)步驟兩種載體的抽提瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量3.兩種載體的限制 性?xún)?nèi)切酶消化4. 目的片段的回收及亞克隆載體的去磷酸化 5.載體與外源DNA的連接6.感受態(tài)細(xì)胞的制備7.連接子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞8. 重組子篩選及鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1.質(zhì)粒的質(zhì)量檢測(cè)，-201保存。 菌種個(gè)人編號(hào)濃度 ng/ul A260/280 1.88 1.86 1.81 1.89 1.86 1.83 1.86 1.80 電 泳結(jié)果，只檢測(cè)條帶不有點(diǎn)marker M5、M6條帶較亮有拖帶，可 能點(diǎn)樣偏多A260/280質(zhì)較好，提取效果比較好M5 P5 M6 P6PUC19 5 6 7 8 5 6 M812

6、 7 8 248.5 325.6 244.6 297.6609.6 603.3 592.2 689.7 2. 瓊脂糖凝膠電泳點(diǎn)樣順序PUC19質(zhì)粒酶切產(chǎn)物（14） pUC19質(zhì)粒對(duì)照（5）Marker（6）M812 質(zhì)粒對(duì)照（7）M812質(zhì)粒酶切產(chǎn)物（811）涂皿生長(zhǎng)結(jié)果5,6,7,8藍(lán)白斑不明顯，肉眼可見(jiàn)藍(lán)色小斑點(diǎn)。陽(yáng)性對(duì)照藍(lán)色 斑點(diǎn)很多也長(zhǎng)了白斑。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能無(wú)菌操作有問(wèn)題，感受態(tài)制備不 好。1234567891011PUC19 PUC19 酶切后實(shí)驗(yàn)二、分子雜交對(duì)于大的基因組，DNA酶切圖譜憑肉眼是分辨不開(kāi)的（EB染 色），因?yàn)榇笮〔坏鹊姆肿映尸F(xiàn)彌散分布，只有借助靈敏的放射 性

7、同位素（或其他發(fā)光物質(zhì)），將靶DNA在凝膠上（膜上）的帶 型通過(guò)特定的探針與之雜交，轉(zhuǎn)換成X光片上直觀的帶型，才能 進(jìn)行相關(guān)分析。另外如果需要鑒定或?qū)ふ遗c已知DNA同源的DNA 片段如：染色體步查、基因組文庫(kù)的評(píng)價(jià)和利用、陽(yáng)性克隆的分 析鑒定、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)分析等也都需進(jìn)行DNA的分子雜交實(shí)驗(yàn)。 雜交探針的標(biāo)記可以采用同位素或地高辛標(biāo)記，兩種標(biāo)記探針的 分子雜交、洗膜過(guò)程和信號(hào)檢測(cè)方法不同。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模核巨D(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性鑒定及拷貝數(shù)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)原理：帶正電荷的尼龍膜強(qiáng)度髙，不易破損，具有較大的DNA結(jié)合 容量，它能夠吸附變性DNA，核酸以共價(jià)結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在 尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有同樣吸附DNA功能，經(jīng)向上的毛細(xì)吸 附作用，在轉(zhuǎn)移緩沖液的帶動(dòng)下把DNA從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA轉(zhuǎn) 到膜上是復(fù)制膠上的帶型，在80-1001真空干燥2-4 hrs，即可 固定DNA。轉(zhuǎn)膜方法一般有兩種，即鹽轉(zhuǎn)移和堿轉(zhuǎn)移，本實(shí)驗(yàn)選用 鹽轉(zhuǎn)移的方法。實(shí)驗(yàn)過(guò)程1.植物總DNA的抽提2.植物總DNA質(zhì)量檢測(cè)3. DNA的瓊 脂糖凝膠電泳 4. 限制性?xún)?nèi)切酶操作 5. Southern Blotting6. 探針的地髙辛標(biāo)記、雜交、免疫反應(yīng)及顯色 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析植物總DNA濃度檢測(cè)結(jié)果