分生補充正負篩選法

1、正負篩選法(positive and negtive selection)正負篩選法的基本方法是：構建一種特殊的載體，該載體含有一段與靶基因同源的序列， 在這段序列的某一外顯子中插入 Ncor 基因作為正選擇標記；在同循序列之外的 3末端， 或3 5兩個末端接上單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的序列作為負篩選標 記。經(jīng)酶切后使其線性化，然后用電脈沖轉染法導入細胞中，繼續(xù)體外培養(yǎng)，并以藥物 G -418 和GANC作雙重篩選。如果所導入的重組DNA與受體細胞基因組DNA之間發(fā)生非同源重組， 則外源基因通常是從頭至尾均整合入受體細胞基因組中，故其基因組中含有外源的基因(Neor, H

2、SV-tk)，此時的Neor和HSV-tk基因同時表達，其中Neor的基因產(chǎn)物使細胞具有 G-418抗性，而HSV-tk基因的產(chǎn)物則將GANC磷酸化產(chǎn)生對細胞有毒性的物質,使細胞死亡。 若為同源重組，外源目的基因及Neor基因會整合到受體細胞基因組同源序列的座位上，而 位于同源序列外端的 HSV-tk 基因則在重組后丟失，因而此時僅有 Neor 表達，受體細胞同 時具有G-418及GANC雙重抗性而在選擇培養(yǎng)基中存活下來。Mansour和Capecchi采用此 方法，已完成ES細胞Hprt, int- 2，hox1.2, hox1.3等基因的定點突變?；蚯贸簩⒓毎蚪M中某基因去除或使基因

3、失去活性的方法。常用同源重組的方法敲除目的基因, 觀察生物或細胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。條件性基因敲除條件性基因打靶(conditional gene targeting),可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特 定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系統(tǒng)與基因打 靶技術相結合的基因打靶技術。它實際上是在常規(guī)的基因打靶的基礎上，利用Cre重組酶介 導的位點特異性重組技術，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設置一個可調(diào)控的“按鈕”，從 而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。條件性基因打靶特點過條件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效應的

4、基因的功能以及基因在持定的組 織細胞或個體發(fā)育特定階段的功能。通過條件性基因激活，實現(xiàn)轉基因的可控制性表達。通過Cre切除條件性基因修復(Cre excision-conditional generepair)，進行基因的可修復性敲除，以研究一個基因的多種功能。誘導性基因打靶它主要由Cre-LoxP及誘導系統(tǒng)組成。Cre-loxP系統(tǒng)由重組酶Cre和該酶的特定作用位點LoxP 組成，其中的重組酶Cre可誘導LoxP所在的DNA發(fā)生缺失、插入、重復、倒位和易位等多 種形式的基因突變或染色體畸變。誘導性基因打靶就是以該系統(tǒng)為基礎、利用控制Cre表達 的啟動子的活性或所表達的 Cre 酶活性具有可誘

5、導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制、 或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉移到動物體內(nèi)的 過程在時間上的可控性、從而在LoxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基 因進行遺傳修飾之目的的基因打靶技術。根據(jù)所用誘導劑的種類，誘導性基因打靶可分為四環(huán)素誘導型、干擾素誘導型(二者所用誘 導劑為控制Cre基因表達的啟動子活性的活化物)和激素誘導型(所用誘導劑為Cre酶活性的 激活物)等幾種類型。而對由病毒或配體/DNA等載體介導的Cre定位表達系統(tǒng)來說，如果其Cre基因的表達或其目的產(chǎn)物Cre酶活性并不需要誘導劑的存在，那么嚴格說來它并不屬于 誘導性基因打靶的

6、范疇。反之，則不失為一種不錯的誘導性基因打靶策略，并且它因為不用 建立Cre的表達或Cre的酶活性具有可誘導特性的轉基因動物而可使成本降低。總之，以Cre-LoxP系統(tǒng)介導的位點特異性重組為基礎的誘導性基因打靶術的確有其優(yōu)勢： 誘導基因突變的時間可人為控制；可避免因基因突變而致死胎的問題；在2個LoxP位點之間的重組率較高；如用病毒或配體/DNA復合物等基因轉移系統(tǒng)來介導Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉基因動物的過程。如果在Cre-ERT和Ad-Cre表達系統(tǒng)中采用組織細胞特異的啟動子來控制Cre的表達，其誘導的基因重組的組織細胞特 異性還可進一步提高?；蛟\斷 基因診斷又稱DNA診斷

7、或分子診斷，通過分子生物學和分子遺傳學的技術，直接檢測出分 子結構水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷。原理：核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一?；蛟\斷技術它的基本原理是:互補的DNA 單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結合是特異的，即嚴格按照堿基 互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。因此， 當用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的 堿基完全配對，它們即互補地結合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序 列。由此可見，進行基因檢測有兩個必要條件，一是必需的特異的DNA探

8、針；二是必需的 基因組DNA。當兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分子雜交。一、基因探針基因探針 （probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可 以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。常用技術 綜述當細胞的基因組DNA用特定的內(nèi)切酶如Eco R I切割時，基因診斷凡有GAATTC的地方 都被切開，得到許多長度一定但互不相等的片段，需要分析、分離的基因或DNA片段就在 其中某一特定的的片段上。然而許多長短不同的DNA片段混合在一起是很難分析的。因此 首先必需將它們按大?。ㄩL短）分離開來，這可借助凝膠電泳來完成。在電泳時，分子

9、量愈 小的片段的遷移愈快，愈大的片段愈慢。因此，在電泳結束時可以獲得一個由大到小連續(xù)的 帶譜（smear）,而由許多細胞基因組得來的某一特定片段，因其長度相同將處于同一位置， 有利于檢出。但凝膠易碎且操作不便。英國科學家Southern首創(chuàng)印跡法克服了上述困難。 Southern 印跡法Southernblot的基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電 泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它 對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段 的位置保持不變。轉移結束后，經(jīng)過80C烘烤的DNA，將

10、原位地固定于膜上。當含有特定基因片段已原位轉移到膜上后，即可與同位素標記了的探針進行雜交，并將雜交的信號 顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交 溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補原 理充分結合。結合是特異的，例如只有B珠蛋白基因DNA才能結合上B珠蛋白的探針。雜 交后，洗去膜上的未組合的探針，將X線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結 合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能 導致帶的缺失或位置改變。分子雜交是基因探測的基礎，除了用印跡雜交外，還有斑點雜交法

11、。即將DNA樣品變 性后直接點在硝酸纖維濾膜上，再與探針雜交，或者將細胞或病毒點在膜上，菌落或菌斑原 位地吸附在膜上，經(jīng)過變性處理，再進行雜交。斑點雜交多用于病原體基因，如微生物的基 因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。聚合酶鏈反應 近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA 片段在短短的 23 小時內(nèi)體外擴增數(shù)十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察， 也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而 通過

12、擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。 首先應按照欲檢測的DNA的5和3端的堿基順序各合成一段長約17 20余個堿基的寡 核苷酸作為引物（primer）,其次是將待檢測的DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP）、 引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴增的DNA鏈復性結合，然后的聚合酶的 作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成 了兩條雙鏈。若繼續(xù)按照變性（92 95C）f復性（40 60C）f引物延伸（65 72C ）的 順序循環(huán)20至40個周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環(huán)20周期可使DNA擴

13、 增2n,即100余萬倍。PCR反應特異性強，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴增的模板 得到大量的擴增片段。毛發(fā)、血痕，甚至單個細胞的DNA即可供PCR擴增之用。因此它用 于病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細胞的檢出、罪犯或個體遺傳物質的鑒定以及遺傳病的基 因診斷等。已可對一系列的遺傳病進行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如a地貧），貝I 在缺失兩端設計一對引物進行擴增，就不會得到擴增產(chǎn)物或只能得到縮短了的擴增產(chǎn)物。如 果疾病是由點突變引起的，而突變的位置和性質已知，貝在設計引物時使之包括突變部位， 由于突變后的堿基不配對，結果無擴增片段；或者在引物設計時于其3端設計一個錯誤的 核苷酸，

14、使之與突變了的核苷酸配對，其結果是正常引物不能擴增，而用錯誤的引物能擴增， 從而可對突變的存在作出判斷。PCR技術目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴大。例如，可用RNA為模板經(jīng)過逆轉錄再行擴增的RTPCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結 果得到大量單鏈產(chǎn)物，稱為不對稱PCR，其單鏈產(chǎn)物可用于序列分析；在一個反應中加入多 對引物同時檢測多個部位的多重PCR等等。擴增片段長度多態(tài)性小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用 于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp

15、-FLP）連鎖分析法。PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有 幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質不明的連鎖分析。 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡 核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針 通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正?；?序列完全一致，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一 致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就

16、可以把只有一 個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。PCR可結合ASO,即PCRASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方 法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。單鏈構象多態(tài)性診斷法單鏈構象多態(tài)性(signlestrand conformation polymorphism, SSCP)是指單鏈 DNA 由于堿 基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不 同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突 變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進

17、行PCR擴增，然后將擴增物用甲酰 胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置 的差異，從而可據(jù)之作出診斷。PCRSSCP 法具有能快速、靈敏地檢測有無點突變或多態(tài)性的優(yōu)點，但如欲闡明突變的堿基性質，則需作序列分析。原核生物基因組和真核生物基因組的區(qū)別：1、真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組(1n)所含有的一整套基因。還包括葉綠體、 線粒體的基因組。原核生物一般只有一個環(huán)狀的DNA分子，其上所含有的基因為一個基因組。2、原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序(unique-sequences), DNA僅 有少量的重復順序和基因。真核生物基

18、因組存在大量的非編碼序列。包括：.內(nèi)含子和外顯子、 .基因家族和假基因、重 復DNA序列。真核生物的基因組的重復順序不但大量，而且存在復雜譜系。3、原核生物的細胞中除了主染色體以外，還含有各種質粒和轉座因子。質粒常為雙鏈環(huán)狀 DNA，可獨立復制，有的既可以游離于細胞質中，也可以整合到染色體上。轉座因子一般都 是整合在基因組中。真核生物除了核染色體以外，還存在細胞器DNA,如線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)狀， 可自主復制。有的真核細胞中也存在質粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于細胞的中央，稱為類核(nucleoid)。 真核生物有細胞核，DNA序列壓縮為染色體存在于細胞核中。5、真核基

19、因組都是由DNA序列組成，原核基因組還有可能由RNA組成，如RNA病毒。DNA 是遺傳信息的載體，故親代 DNA 必須以自身分子為模板準確的復制成兩個拷貝，并分 配到兩個子細胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而 DNA 的雙鏈結構對于維持這類遺傳 物質的穩(wěn)定性和復制的準確性都是極為重要的。DNA的半保留復制Waston和Click在提出DNA雙螺旋結構模型時曾就DNA復制過程進行過研究，他們推測， DNA在復制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋分開，每條鏈分別作模板合成新鏈, 每個子代 DNA 的一條鏈來自親代，另一條則是新合成的，故稱之為半保留式復制 (semiconservative

20、replication)。1958 年 Meselson 和 Stahl 進行了如圖8-3-5 的實驗證明了 DNA 分子是以半保留方式進行自 我復制的。BACTERIALVAI I 囂f BACTERIA GROWN IN MEDIUM CONTAINING IfLAVY ISOTOPE OF NITIiOGEHTRNSFfRHACTfcRIA to e i(;ht tFnrirMSLiPEND 1NA TN CESIUM CHLOniDE dLUTTOXBREAK 刖EM CELLS AND EXTRACT DMAILIJ TO GROW, SAMPLINGAT VARIOUS TIMES

21、BACTERIALVAI I 囂f BACTERIA GROWN IN MEDIUM CONTAINING IfLAVY ISOTOPE OF NITIiOGEHTRNSFfRHACTfcRIA to e i(;ht tFnrirMSLiPEND 1NA TN CESIUM CHLOniDE dLUTTOXBREAK 刖EM CELLS AND EXTRACT DMAILIJ TO GROW, SAMPLINGAT VARIOUS TIMES細菌培養(yǎng)在含N的培養(yǎng)基中 細菌培養(yǎng)含I X的培養(yǎng)基中一代兩代CENTR3FUC；E soiunoN TO SrPAHATEhNA UY ITS WEK1I

22、 IT圖 8-3-5 Meselson 和 Stahl 證明 DNA 半保留復制的實驗（二）DNA復制的起始，方向和速度DNA在復制時，雙鏈DNA解旋成兩股分別進行。其復制過程的復制起點呈現(xiàn)叉子的形 式，故稱復制叉。以復制叉向前移動的方向為標準，一條模板鏈為 35走向，在其 上DNA能以5 一3方向連續(xù)合成，稱為前導鏈leading strand）；另一條模板鏈為5 一 3走向，在其上 DNA 也是 53方向合成，但與復制叉移動的方向正好相反，故隨 著復制叉的移動形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的 DNA 鏈，該鏈稱為后 隨鏈（lagging strand）。實驗證明DNA的復制是

23、由一個固定的起始點開始的。一般把生物體的 單個復制單位稱為復制子。一個復制子只含一個復制起點。一般說，細菌，病毒即線粒體 DNA 分子均作為單個復制子完成其復制，真核生物基因組可以同時在多個復制起點上進行 雙向復制，即它們的基因組包括多個復制子。多方面的實驗結果表明，大多數(shù)生物內(nèi) DNA 的復制都是從固定的起始點以雙向等速方式進行的。復制叉以DNA分子上某一特定順序為 起始點，向兩個方向等速生長前進。5|卯蠱白、3頷叢iii土尿桿厲復就過再中曲除墮胡人時人堪合;5 =5|卯蠱白、3頷叢iii土尿桿厲復就過再中曲除墮胡人時人堪合;5 =守制遼秸就方向圖8-3-6 DNA復制過程DNA復制過程DN

24、A復制過程以原核生物DNA復制過程予以簡要說明DNA雙螺旋的解旋DNA 在復制時，其雙鏈首先解開，形成復制叉，而復制叉的形成則是由多種蛋白質及 酶參與的較復雜的復制過程( 1 )單鏈 DNA 結合蛋白( single stranded DNA binding protein, ssbDNA 蛋白)ssbDNA蛋白是較牢固的結合在單鏈DNA上的蛋白質。原核生物ssbDNA蛋白與DNA結 合時表現(xiàn)出協(xié)同效應：若第1個ssbDNA蛋白結合到DNA上去能力為1,第2個的結合能力 可高達103；真核生物細胞中的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結合時則不表現(xiàn)上述效應。ssbDNA 蛋白的作用是保證解旋酶解開的

25、單鏈在復制完成前能保持單鏈結構,它以四聚體的形式存在 于復制叉處，待單鏈復制后才脫下來，重新循環(huán)。所以，ssbDNA蛋白只保持單鏈的存在， 不起解旋作用。DNA 解鏈酶(DNA helicase)DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量以解開雙鏈DNA。這種解鏈酶分解ATP的活性依 賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結合在 這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動。復制時，大部分DNA解旋酶可沿滯后模板的5 3方向并隨著復制叉的前進而移動，只有個別解旋酶(Rep蛋白)是沿著35方向 移動的。故推測Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解

26、開雙 鏈 DNA。DNA解鏈過程DNA 在復制前不僅是雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在是解鏈前的必 須結構狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外還有一些特定蛋白質，如大腸桿菌中的Dna蛋白等。 一旦DNA局部雙鏈解開，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開的單鏈，保證此局部不會恢復成 雙鏈。兩條單鏈DNA復制的引發(fā)過程有所差異，但是不論是前導鏈還是后隨鏈，都需要一 段RNA引物用于開始子鏈DNA的合成。因此前導鏈與后隨鏈的差別在于前者從復制起始點 開始按 53持續(xù)的合成下去，不形成岡崎片段，后者則隨著復制叉的出現(xiàn)，不斷合成 長約23kb的岡崎片段。岡崎片段與半不連續(xù)復制因DNA的兩條鏈是反向平行的

27、，故在復制叉附近解開的DNA鏈，一條是53方 向，另一條是35方向，兩個模板極性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5 3方向，不是35方向，因而無法解釋DNA的兩條鏈同時進行復制的問題。 為解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速復制現(xiàn)象，日本學者岡崎(Okazaki)等人提出了 DNA的半連續(xù)復制(semidiscontinuous replication)模型。1968年岡崎用3H脫氧胸苷短時 間標記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標記的，被后人稱作岡崎 片段的DNA。延長標記時間后，岡崎片段可轉變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復制 過程中的中間產(chǎn)物。另一個實驗也

28、證明DNA復制過程中首先合成較小的片段，即用DNA連 接酶溫度敏感突變株進行試驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段積累， 表明DNA復制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段,然后再由連接酶鏈成大分子DNA。 一般說，原核生物的岡崎片段比真核生物的長。深入研究還證明，前導鏈的連續(xù)復制和滯后 鏈的不連續(xù)復制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復制。3復制的引發(fā)和終止所有的DNA的復制都是從一個固定的起始點開始的，而DNA聚合酶只能延長已存在的 DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈，新DNA的復制是如何形成的？經(jīng)大量實驗研究證明，DNA 復制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物 3端開始合成新的 DNA 鏈。對于前導鏈來說，這一引發(fā)過程比較簡單，只要有一段 RNA 引物， DNA 聚合酶就能以此為起點，一直合成下去。對于后隨鏈，引發(fā)過程較為復雜，需 要多種蛋白質和酶參與。后隨鏈的引發(fā)過程由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由 6種蛋白質構成，預 引體或引體前體把這 6 種蛋白質結合在一起并和引發(fā)酶或引物過程酶進一步組裝形成引發(fā) 體。引發(fā)體似火車頭一樣在后隨鏈分叉的方向前進，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈 的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶I