分生補充正負(fù)篩選法

1、正負(fù)篩選法(positive and negtive selection)正負(fù)篩選法的基本方法是：構(gòu)建一種特殊的載體，該載體含有一段與靶基因同源的序列， 在這段序列的某一外顯子中插入 Ncor 基因作為正選擇標(biāo)記；在同循序列之外的 3末端， 或3 5兩個末端接上單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的序列作為負(fù)篩選標(biāo) 記。經(jīng)酶切后使其線性化，然后用電脈沖轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入細胞中，繼續(xù)體外培養(yǎng)，并以藥物 G -418 和GANC作雙重篩選。如果所導(dǎo)入的重組DNA與受體細胞基因組DNA之間發(fā)生非同源重組， 則外源基因通常是從頭至尾均整合入受體細胞基因組中，故其基因組中含有外源的基因(Neor, H

2、SV-tk)，此時的Neor和HSV-tk基因同時表達，其中Neor的基因產(chǎn)物使細胞具有 G-418抗性，而HSV-tk基因的產(chǎn)物則將GANC磷酸化產(chǎn)生對細胞有毒性的物質(zhì),使細胞死亡。 若為同源重組，外源目的基因及Neor基因會整合到受體細胞基因組同源序列的座位上，而 位于同源序列外端的 HSV-tk 基因則在重組后丟失，因而此時僅有 Neor 表達，受體細胞同 時具有G-418及GANC雙重抗性而在選擇培養(yǎng)基中存活下來。Mansour和Capecchi采用此 方法，已完成ES細胞Hprt, int- 2，hox1.2, hox1.3等基因的定點突變。基因敲除：將細胞基因組中某基因去除或使基因

3、失去活性的方法。常用同源重組的方法敲除目的基因, 觀察生物或細胞的表型變化，是研究基因功能的重要手段。條件性基因敲除條件性基因打靶(conditional gene targeting),可定義為將某個基因的修飾限制于小鼠某些特 定類型的細胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系統(tǒng)與基因打 靶技術(shù)相結(jié)合的基因打靶技術(shù)。它實際上是在常規(guī)的基因打靶的基礎(chǔ)上，利用Cre重組酶介 導(dǎo)的位點特異性重組技術(shù)，在對小鼠基因修飾的時空范圍上設(shè)置一個可調(diào)控的“按鈕”，從 而使對小鼠基因組的修飾的范圍和時間處于一種可控狀態(tài)。條件性基因打靶特點過條件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效應(yīng)的

4、基因的功能以及基因在持定的組 織細胞或個體發(fā)育特定階段的功能。通過條件性基因激活，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的可控制性表達。通過Cre切除條件性基因修復(fù)(Cre excision-conditional generepair)，進行基因的可修復(fù)性敲除，以研究一個基因的多種功能。誘導(dǎo)性基因打靶它主要由Cre-LoxP及誘導(dǎo)系統(tǒng)組成。Cre-loxP系統(tǒng)由重組酶Cre和該酶的特定作用位點LoxP 組成，其中的重組酶Cre可誘導(dǎo)LoxP所在的DNA發(fā)生缺失、插入、重復(fù)、倒位和易位等多 種形式的基因突變或染色體畸變。誘導(dǎo)性基因打靶就是以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)、利用控制Cre表達 的啟動子的活性或所表達的 Cre 酶活性具有可誘

5、導(dǎo)的特點，通過對誘導(dǎo)劑給予時間的控制、 或利用Cre基因定位表達系統(tǒng)中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動物體內(nèi)的 過程在時間上的可控性、從而在LoxP動物的一定發(fā)育階段和一定組織細胞中實現(xiàn)對特定基 因進行遺傳修飾之目的的基因打靶技術(shù)。根據(jù)所用誘導(dǎo)劑的種類，誘導(dǎo)性基因打靶可分為四環(huán)素誘導(dǎo)型、干擾素誘導(dǎo)型(二者所用誘 導(dǎo)劑為控制Cre基因表達的啟動子活性的活化物)和激素誘導(dǎo)型(所用誘導(dǎo)劑為Cre酶活性的 激活物)等幾種類型。而對由病毒或配體/DNA等載體介導(dǎo)的Cre定位表達系統(tǒng)來說，如果其Cre基因的表達或其目的產(chǎn)物Cre酶活性并不需要誘導(dǎo)劑的存在，那么嚴(yán)格說來它并不屬于 誘導(dǎo)性基因打靶的

6、范疇。反之，則不失為一種不錯的誘導(dǎo)性基因打靶策略，并且它因為不用 建立Cre的表達或Cre的酶活性具有可誘導(dǎo)特性的轉(zhuǎn)基因動物而可使成本降低。總之，以Cre-LoxP系統(tǒng)介導(dǎo)的位點特異性重組為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)性基因打靶術(shù)的確有其優(yōu)勢： 誘導(dǎo)基因突變的時間可人為控制；可避免因基因突變而致死胎的問題；在2個LoxP位點之間的重組率較高；如用病毒或配體/DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動物的過程。如果在Cre-ERT和Ad-Cre表達系統(tǒng)中采用組織細胞特異的啟動子來控制Cre的表達，其誘導(dǎo)的基因重組的組織細胞特 異性還可進一步提高?；蛟\斷 基因診斷又稱DNA診斷

7、或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)，直接檢測出分 子結(jié)構(gòu)水平和表達水平是否異常，從而對疾病做出判斷。原理：核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一?；蛟\斷技術(shù)它的基本原理是:互補的DNA 單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基 互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。因此， 當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的 堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序 列。由此可見，進行基因檢測有兩個必要條件，一是必需的特異的DNA探

8、針；二是必需的 基因組DNA。當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分子雜交。一、基因探針基因探針 （probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可 以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。常用技術(shù) 綜述當(dāng)細胞的基因組DNA用特定的內(nèi)切酶如Eco R I切割時，基因診斷凡有GAATTC的地方 都被切開，得到許多長度一定但互不相等的片段，需要分析、分離的基因或DNA片段就在 其中某一特定的的片段上。然而許多長短不同的DNA片段混合在一起是很難分析的。因此 首先必需將它們按大?。ㄩL短）分離開來，這可借助凝膠電泳來完成。在電泳時，分子

9、量愈 小的片段的遷移愈快，愈大的片段愈慢。因此，在電泳結(jié)束時可以獲得一個由大到小連續(xù)的 帶譜（smear）,而由許多細胞基因組得來的某一特定片段，因其長度相同將處于同一位置， 有利于檢出。但凝膠易碎且操作不便。英國科學(xué)家Southern首創(chuàng)印跡法克服了上述困難。 Southern 印跡法Southernblot的基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當(dāng)電 泳后凝膠經(jīng)過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再于其上方壓上多層干燥的吸水紙，借助它 對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉(zhuǎn)移到濾膜上。轉(zhuǎn)移是原位的，即DNA片段 的位置保持不變。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，經(jīng)過80C烘烤的DNA，將

10、原位地固定于膜上。當(dāng)含有特定基因片段已原位轉(zhuǎn)移到膜上后，即可與同位素標(biāo)記了的探針進行雜交，并將雜交的信號 顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內(nèi)放置上述雜交濾膜，加入含有變性后探針的雜交 溶液后，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定于膜上的單鏈基因DNA分子按堿基到互補原 理充分結(jié)合。結(jié)合是特異的，例如只有B珠蛋白基因DNA才能結(jié)合上B珠蛋白的探針。雜 交后，洗去膜上的未組合的探針，將X線膠片覆于膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結(jié) 合了同位素標(biāo)記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能 導(dǎo)致帶的缺失或位置改變。分子雜交是基因探測的基礎(chǔ)，除了用印跡雜交外，還有斑點雜交法

11、。即將DNA樣品變 性后直接點在硝酸纖維濾膜上，再與探針雜交，或者將細胞或病毒點在膜上，菌落或菌斑原 位地吸附在膜上，經(jīng)過變性處理，再進行雜交。斑點雜交多用于病原體基因，如微生物的基 因，但也可用于檢查人類基因組中的DNA序列。聚合酶鏈反應(yīng) 近年來，基因分析和基因工程技術(shù)有了革命性的突破，這主要歸功于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）的發(fā)展和應(yīng)用。應(yīng)用PCR技術(shù)可以使特定的基因或DNA 片段在短短的 23 小時內(nèi)體外擴增數(shù)十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察， 也可用于進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而 通過

12、擴增至百萬倍后直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數(shù)小時。 首先應(yīng)按照欲檢測的DNA的5和3端的堿基順序各合成一段長約17 20余個堿基的寡 核苷酸作為引物（primer）,其次是將待檢測的DNA變性后，加入四種單核苷酸（dNTP）、 引物和耐熱聚合酶。在較低的溫度，引物將與待擴增的DNA鏈復(fù)性結(jié)合，然后的聚合酶的 作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不斷延伸合成新互補鏈，這樣，一條DNA雙鏈就變成 了兩條雙鏈。若繼續(xù)按照變性（92 95C）f復(fù)性（40 60C）f引物延伸（65 72C ）的 順序循環(huán)20至40個周期，就可以得到大量的DNA片段。理論上循環(huán)20周期可使DNA擴

13、 增2n,即100余萬倍。PCR反應(yīng)特異性強，靈敏度高，極微量的DNA即可作為擴增的模板 得到大量的擴增片段。毛發(fā)、血痕，甚至單個細胞的DNA即可供PCR擴增之用。因此它用 于病原體DNA的檢查、腫瘤殘留細胞的檢出、罪犯或個體遺傳物質(zhì)的鑒定以及遺傳病的基 因診斷等。已可對一系列的遺傳病進行PCR診斷。如果疾病是由基因缺失引起的（如a地貧），貝I 在缺失兩端設(shè)計一對引物進行擴增，就不會得到擴增產(chǎn)物或只能得到縮短了的擴增產(chǎn)物。如 果疾病是由點突變引起的，而突變的位置和性質(zhì)已知，貝在設(shè)計引物時使之包括突變部位， 由于突變后的堿基不配對，結(jié)果無擴增片段；或者在引物設(shè)計時于其3端設(shè)計一個錯誤的 核苷酸，

14、使之與突變了的核苷酸配對，其結(jié)果是正常引物不能擴增，而用錯誤的引物能擴增， 從而可對突變的存在作出判斷。PCR技術(shù)目前有許多新的發(fā)展，用途日益擴大。例如，可用RNA為模板經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄再行擴增的RTPCR；改變兩引物濃度，使其相差100倍，結(jié) 果得到大量單鏈產(chǎn)物，稱為不對稱PCR，其單鏈產(chǎn)物可用于序列分析；在一個反應(yīng)中加入多 對引物同時檢測多個部位的多重PCR等等。擴增片段長度多態(tài)性小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用 于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，Amp

15、-FLP）連鎖分析法。PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有 幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等基因特異的寡 核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進行診斷。探針 通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正?；?序列完全一致，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一 致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就

16、可以把只有一 個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。PCR可結(jié)合ASO,即PCRASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方 法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。單鏈構(gòu)象多態(tài)性診斷法單鏈構(gòu)象多態(tài)性(signlestrand conformation polymorphism, SSCP)是指單鏈 DNA 由于堿 基序列的不同可引起構(gòu)象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不 同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突 變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物進

17、行PCR擴增，然后將擴增物用甲酰 胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置 的差異，從而可據(jù)之作出診斷。PCRSSCP 法具有能快速、靈敏地檢測有無點突變或多態(tài)性的優(yōu)點，但如欲闡明突變的堿基性質(zhì)，則需作序列分析。原核生物基因組和真核生物基因組的區(qū)別：1、真核生物基因組指一個物種的單倍體染色體組(1n)所含有的一整套基因。還包括葉綠體、 線粒體的基因組。原核生物一般只有一個環(huán)狀的DNA分子，其上所含有的基因為一個基因組。2、原核生物的染色體分子量較小，基因組含有大量單一順序(unique-sequences), DNA僅 有少量的重復(fù)順序和基因。真核生物基

18、因組存在大量的非編碼序列。包括：.內(nèi)含子和外顯子、 .基因家族和假基因、重 復(fù)DNA序列。真核生物的基因組的重復(fù)順序不但大量，而且存在復(fù)雜譜系。3、原核生物的細胞中除了主染色體以外，還含有各種質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座因子。質(zhì)粒常為雙鏈環(huán)狀 DNA，可獨立復(fù)制，有的既可以游離于細胞質(zhì)中，也可以整合到染色體上。轉(zhuǎn)座因子一般都 是整合在基因組中。真核生物除了核染色體以外，還存在細胞器DNA,如線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)狀， 可自主復(fù)制。有的真核細胞中也存在質(zhì)粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于細胞的中央，稱為類核(nucleoid)。 真核生物有細胞核，DNA序列壓縮為染色體存在于細胞核中。5、真核基

19、因組都是由DNA序列組成，原核基因組還有可能由RNA組成，如RNA病毒。DNA 是遺傳信息的載體，故親代 DNA 必須以自身分子為模板準(zhǔn)確的復(fù)制成兩個拷貝，并分 配到兩個子細胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而 DNA 的雙鏈結(jié)構(gòu)對于維持這類遺傳 物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。DNA的半保留復(fù)制Waston和Click在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時曾就DNA復(fù)制過程進行過研究，他們推測， DNA在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋分開，每條鏈分別作模板合成新鏈, 每個子代 DNA 的一條鏈來自親代，另一條則是新合成的，故稱之為半保留式復(fù)制 (semiconservative

20、replication)。1958 年 Meselson 和 Stahl 進行了如圖8-3-5 的實驗證明了 DNA 分子是以半保留方式進行自 我復(fù)制的。BACTERIALVAI I 囂f BACTERIA GROWN IN MEDIUM CONTAINING IfLAVY ISOTOPE OF NITIiOGEHTRNSFfRHACTfcRIA to e i(;ht tFnrirMSLiPEND 1NA TN CESIUM CHLOniDE dLUTTOXBREAK 刖EM CELLS AND EXTRACT DMAILIJ TO GROW, SAMPLINGAT VARIOUS TIMES

21、BACTERIALVAI I 囂f BACTERIA GROWN IN MEDIUM CONTAINING IfLAVY ISOTOPE OF NITIiOGEHTRNSFfRHACTfcRIA to e i(;ht tFnrirMSLiPEND 1NA TN CESIUM CHLOniDE dLUTTOXBREAK 刖EM CELLS AND EXTRACT DMAILIJ TO GROW, SAMPLINGAT VARIOUS TIMES細菌培養(yǎng)在含N的培養(yǎng)基中 細菌培養(yǎng)含I X的培養(yǎng)基中一代兩代CENTR3FUC；E soiunoN TO SrPAHATEhNA UY ITS WEK1I

22、 IT圖 8-3-5 Meselson 和 Stahl 證明 DNA 半保留復(fù)制的實驗（二）DNA復(fù)制的起始，方向和速度DNA在復(fù)制時，雙鏈DNA解旋成兩股分別進行。其復(fù)制過程的復(fù)制起點呈現(xiàn)叉子的形 式，故稱復(fù)制叉。以復(fù)制叉向前移動的方向為標(biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈為 35走向，在其 上DNA能以5 一3方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈leading strand）；另一條模板鏈為5 一 3走向，在其上 DNA 也是 53方向合成，但與復(fù)制叉移動的方向正好相反，故隨 著復(fù)制叉的移動形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的 DNA 鏈，該鏈稱為后 隨鏈（lagging strand）。實驗證明DNA的復(fù)制是

23、由一個固定的起始點開始的。一般把生物體的 單個復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個復(fù)制子只含一個復(fù)制起點。一般說，細菌，病毒即線粒體 DNA 分子均作為單個復(fù)制子完成其復(fù)制，真核生物基因組可以同時在多個復(fù)制起點上進行 雙向復(fù)制，即它們的基因組包括多個復(fù)制子。多方面的實驗結(jié)果表明，大多數(shù)生物內(nèi) DNA 的復(fù)制都是從固定的起始點以雙向等速方式進行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序為 起始點，向兩個方向等速生長前進。5|卯蠱白、3頷叢iii土尿桿厲復(fù)就過再中曲除墮胡人時人堪合;5 =5|卯蠱白、3頷叢iii土尿桿厲復(fù)就過再中曲除墮胡人時人堪合;5 =守制遼秸就方向圖8-3-6 DNA復(fù)制過程DNA復(fù)制過程DN

24、A復(fù)制過程以原核生物DNA復(fù)制過程予以簡要說明DNA雙螺旋的解旋DNA 在復(fù)制時，其雙鏈?zhǔn)紫冉忾_，形成復(fù)制叉，而復(fù)制叉的形成則是由多種蛋白質(zhì)及 酶參與的較復(fù)雜的復(fù)制過程( 1 )單鏈 DNA 結(jié)合蛋白( single stranded DNA binding protein, ssbDNA 蛋白)ssbDNA蛋白是較牢固的結(jié)合在單鏈DNA上的蛋白質(zhì)。原核生物ssbDNA蛋白與DNA結(jié) 合時表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：若第1個ssbDNA蛋白結(jié)合到DNA上去能力為1,第2個的結(jié)合能力 可高達103；真核生物細胞中的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結(jié)合時則不表現(xiàn)上述效應(yīng)。ssbDNA 蛋白的作用是保證解旋酶解開的

25、單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu),它以四聚體的形式存在 于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才脫下來，重新循環(huán)。所以，ssbDNA蛋白只保持單鏈的存在， 不起解旋作用。DNA 解鏈酶(DNA helicase)DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量以解開雙鏈DNA。這種解鏈酶分解ATP的活性依 賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在 這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動。復(fù)制時，大部分DNA解旋酶可沿滯后模板的5 3方向并隨著復(fù)制叉的前進而移動，只有個別解旋酶(Rep蛋白)是沿著35方向 移動的。故推測Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解

26、開雙 鏈 DNA。DNA解鏈過程DNA 在復(fù)制前不僅是雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在是解鏈前的必 須結(jié)構(gòu)狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外還有一些特定蛋白質(zhì)，如大腸桿菌中的Dna蛋白等。 一旦DNA局部雙鏈解開，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開的單鏈，保證此局部不會恢復(fù)成 雙鏈。兩條單鏈DNA復(fù)制的引發(fā)過程有所差異，但是不論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈，都需要一 段RNA引物用于開始子鏈DNA的合成。因此前導(dǎo)鏈與后隨鏈的差別在于前者從復(fù)制起始點 開始按 53持續(xù)的合成下去，不形成岡崎片段，后者則隨著復(fù)制叉的出現(xiàn)，不斷合成 長約23kb的岡崎片段。岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制因DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?/p>

27、，故在復(fù)制叉附近解開的DNA鏈，一條是53方 向，另一條是35方向，兩個模板極性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5 3方向，不是35方向，因而無法解釋DNA的兩條鏈同時進行復(fù)制的問題。 為解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速復(fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎(Okazaki)等人提出了 DNA的半連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuous replication)模型。1968年岡崎用3H脫氧胸苷短時 間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標(biāo)記的，被后人稱作岡崎 片段的DNA。延長標(biāo)記時間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復(fù)制 過程中的中間產(chǎn)物。另一個實驗也

28、證明DNA復(fù)制過程中首先合成較小的片段，即用DNA連 接酶溫度敏感突變株進行試驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段積累， 表明DNA復(fù)制過程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段,然后再由連接酶鏈成大分子DNA。 一般說，原核生物的岡崎片段比真核生物的長。深入研究還證明，前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后 鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。3復(fù)制的引發(fā)和終止所有的DNA的復(fù)制都是從一個固定的起始點開始的，而DNA聚合酶只能延長已存在的 DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈，新DNA的復(fù)制是如何形成的？經(jīng)大量實驗研究證明，DNA 復(fù)制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物 3端開始合成新的 DNA 鏈。對于前導(dǎo)鏈來說，這一引發(fā)過程比較簡單，只要有一段 RNA 引物， DNA 聚合酶就能以此為起點，一直合成下去。對于后隨鏈，引發(fā)過程較為復(fù)雜，需 要多種蛋白質(zhì)和酶參與。后隨鏈的引發(fā)過程由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由 6種蛋白質(zhì)構(gòu)成，預(yù) 引體或引體前體把這 6 種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并和引發(fā)酶或引物過程酶進一步組裝形成引發(fā) 體。引發(fā)體似火車頭一樣在后隨鏈分叉的方向前進，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈 的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶I