酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)課件

1、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） -雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） -免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫標(biāo)記技術(shù)：是以特異性的抗原、抗體分子與一些易測(cè)定的、具有高度敏感性的標(biāo)記物質(zhì)相結(jié)合，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原、抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括了熒光素、酶和放射性核素等。三大免疫標(biāo)記技術(shù)特異性、敏感性、快速性免疫標(biāo)記技術(shù) 免疫標(biāo)記技術(shù)：是以特異性的抗原、抗體分子與在免疫標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用中，其技術(shù)內(nèi)容主要包括了兩大方面：標(biāo)記物與抗原、抗體的連接技術(shù)；標(biāo)記后的抗原、抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理以及相應(yīng)的檢測(cè)儀器的使用原理和方法。如熒光顯微鏡、-液閃儀、酶標(biāo)儀等的使用。常用的

2、免疫標(biāo)記技術(shù)的實(shí)驗(yàn)類型主要有熒光標(biāo)記技術(shù)放射免疫測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在免疫標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用中，其技術(shù)內(nèi)容主要包括了兩大方面：掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的基本原理。掌握三大免疫標(biāo)記技術(shù)的工作原理及主要實(shí)驗(yàn)類型的原理和方法。熟悉ELISA試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理。了解免疫標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。掌握免疫標(biāo)記技術(shù)的基本原理。酶免疫測(cè)定類型 酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定類型 酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)

3、展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 1971年瑞典學(xué)者En原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA） 將抗原或抗體固定在固相載體表面，并保持其免疫活性，再與酶標(biāo)記抗體或抗原聯(lián)結(jié)，并保留酶的活性，然后加入酶反應(yīng)的底物，后者被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，反應(yīng)顏色的深淺可與相應(yīng)抗原或抗體的量相關(guān)。原理酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）固相載體聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA （微量板ELISA）；硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點(diǎn)ELISA（Dot-

4、ELISA）；疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（CELISA）。固相載體聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的E聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上包被的方式將抗原或抗體固定在固相載體上的過(guò)程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)

5、上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。包被的方式不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相

6、表面。優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析包被用抗原： 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。 合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。包被用抗原：包被用抗體IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)接發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異

7、性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。包被用抗體包被的條件pH9.6碳酸鹽緩沖液pH7.2的磷酸鹽緩沖液pH7-8的Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8冰箱中放置過(guò)夜，37中保溫2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。包被的條件封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0

8、.05%-0.5%的BSA 10%的小牛血清1%明膠脫脂奶粉（5%）封閉(blocking)洗滌液含0.05% Tween-20 磷酸鹽緩沖液。洗滌液酶結(jié)合物酶結(jié)合物是ELISA中最重要的試劑良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件： 高效價(jià)的抗體和高活性的酶酶結(jié)合物 酶用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性： 有高度的活性和敏感性 純度高 催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高 專一性強(qiáng) 性質(zhì)穩(wěn)定 來(lái)源豐富 反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn),有色產(chǎn)物易于測(cè)定 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力 底物易于制備和保存 價(jià)格低廉 能商品化生產(chǎn)。 酶用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：常用的酶HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。

9、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)常用的酶結(jié)合物用的抗原和抗體抗體的活性和純度： 特異性免疫反應(yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可高稀釋度使用，減少非特異性吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是

10、高純度的。結(jié)合物用的抗原和抗體 戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.結(jié)合物的制備 戊二醛交聯(lián)法：結(jié)合物的制備 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合

11、物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定保存酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑抗生素（例如慶大霉素）防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)課件結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。 為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上： 0.1%牛血清白蛋白 0.05% Tween-20 。 試劑盒均已用合

12、適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-8保存期可達(dá)6個(gè)月。結(jié)合物的稀釋液酶的底物 E DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2為供氧體， H2O2為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS 。酶的底物HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)。 供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長(zhǎng)為492nmTMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，用HCL或H2SO4終止后，由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長(zhǎng)為450nm .TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與

13、H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。AP為磷酸酯酶 一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)。洗滌液 常用的洗滌液為含0.05% Tween-20 的磷酸鹽緩沖液。酶反應(yīng)終止液 HRP反應(yīng)終止液為硫酸，一般采用2mol/L AP用NaOH終止洗滌液 常用的洗滌液為含0.05% Tween-20ELISA的種類和變化 雙抗體夾心法 此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsA

14、g、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物。ELISA的種類和變化 雙抗體夾心法間接法 間接法是檢測(cè)抗體常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。傳染病的診斷。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)課件競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于小分子抗原和半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體 。被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來(lái)確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少，有色產(chǎn)物就減少，這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。

15、此法的優(yōu)點(diǎn)在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測(cè)；小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。競(jìng)爭(zhēng)法 雙位點(diǎn)一步法用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。雙位點(diǎn)一步法用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)捕獲法 測(cè)IgM抗體先將針對(duì)IgM的第二抗體（如羊抗人IgM鏈抗體）連接于固相載體，用以結(jié)合（“捕獲”）樣品中所有IgM（特異或非特異），洗滌出去IgG等無(wú)關(guān)物質(zhì)，然后加入特異抗原與待檢IgM結(jié)合；

16、再加入抗原特異的酶標(biāo)抗體，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，加酶底物作用顯色后，即可對(duì)樣品中待檢IgM是否存在及其含量進(jìn)行測(cè)定。此法常用于病毒性感染的早期診斷。捕獲法 測(cè)IgM抗體先將針對(duì)IgM的第二抗體（如羊抗人IgM應(yīng)用親和素和生物素的ELISA 親和素是一種糖蛋白，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4個(gè)生物素分子親密結(jié)合。鏈霉親和素（strepavidin）。 生物素（biotin）又稱維生素H，用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。 親和素與生物素

17、的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。 由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來(lái)，就可大提高ELISA的敏感度。 應(yīng)用親和素和生物素的ELISA 應(yīng)用親和素和生物素的ELISA 親和素生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式：在固相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結(jié)合，通過(guò)親和素生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。在常規(guī)ELISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連

18、接親和素酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號(hào)應(yīng)用親和素和生物素的ELISA 親和素生物素系統(tǒng)在ELI在本實(shí)驗(yàn)中（1）用已知抗體包被固相載體；（2）加入受檢的標(biāo)本（含待測(cè)抗 原），使抗原與固相上的抗 體結(jié)合；（3）加入以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的已知抗體，使之與抗原結(jié) 合。標(biāo)記的酶可催化底物 （四甲基聯(lián)苯胺）起顯色反應(yīng)， 從而指示特異性抗原抗體反 應(yīng)的存在。在本實(shí)驗(yàn)中器材與試劑器材：（1）50250l可調(diào)微量移液器與移液頭（2）37培養(yǎng)箱、搪瓷盒（3）酶標(biāo)專用架（4）洗瓶（含洗滌液）、吸水毛巾（5）酶標(biāo)檢測(cè)儀器材與試劑器材：試劑：（1）已包被抗體的酶標(biāo)條（2）400g/L抗原溶液（3）抗原稀釋液（4）待測(cè)標(biāo)本1、2（5）酶標(biāo)抗體（6）洗滌液（pH7.2 PBS-Tween 20）（7）底物A、B溶液（8）終止液試劑：操作步驟取已包被抗體的酶標(biāo)板，分別在第16孔各加入抗原稀釋液100 ul，第6、7孔各加入400g/L抗原溶液100 ul，從第62孔進(jìn)行對(duì)倍稀釋（最后在第2孔吸出的100 ul棄去）；在第8、9孔各加入100 ul待測(cè)標(biāo)本1；在第10、11孔各加入100 u