黃連上清丸微生物限度檢查方法學(xué)驗證

1、黃連上清丸微生物限度檢查方法學(xué)驗證【摘要】目的：對黃連上清丸微生物限度檢查方法進(jìn)展方法學(xué)驗證。方法：采用平皿記數(shù)法，分組分別使用5種實驗菌驗證。試驗組取供試液加菌液注入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌液組分別取各實驗菌液注入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。稀釋劑對照組取稀釋劑加菌液注入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。供試品對照組取供試液注入培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過3次獨(dú)立的平行試驗，分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。采用觀察大腸埃希菌、大腸菌群與陰性金黃色葡萄球菌在一樣環(huán)境下的培養(yǎng)來驗證控制菌的檢查方法。結(jié)果：各試驗菌的回收率均高于70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高于70%。結(jié)論：采用常規(guī)法可以進(jìn)展本品的微生物限度檢查?！娟P(guān)鍵詞】黃連上清丸微生物

2、限度檢查方法驗證Abstratbjetive：TverifytheirrganisliitedinspetingethdfHuanglianShangqingpill.ethd：Plateuntingethdasusedtunt.Trailliquidandbaterialliquid，fivebaterialliquids，diluteliquidandbaterialliquid，trailliquidererespetivelyinjetedintultureediuftrialgrup，baterialliquidgrup，dilutinbilingualgrup，trailliqui

3、dntrlgrup.Everytrailreveryrateasalulatedinthreeindependenttrails.ThentrlbateriahekingethdasverifiedbybservingultivatinfEsherihiali，lifrandpsitivestaphybusaureusunderthesaeenvirnent.Result：Theratefeverytrailbateriaashigherthan70%，andtheratesffivedilutedtrailbateriaserehigherthan70%.nlusin：Theirrganis

4、liitedinspetingfHuanglianShangqingpillanbeused.KeyrdsHuanglianShangqingpill;irrganisliitedinspetingethd;verifiatin黃連上清丸具有散風(fēng)清熱、瀉火止痛的成效，用于治療風(fēng)熱上攻、肺胃熱盛所致的頭暈?zāi)垦?、牙齒疼痛、口舌生瘡等。其療效確切，患者認(rèn)可，并為中國藥典2022年版收載。消費(fèi)企業(yè)為了適應(yīng)市場需要和方便患者服用，申請將大蜜丸改變?yōu)樗琛，F(xiàn)根據(jù)中國藥典2022年版要求，對非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料進(jìn)展微生物限度檢查，同時進(jìn)展方法學(xué)驗證。為確保檢驗方法的準(zhǔn)確性和可靠性，對該品種的微生物限

5、度檢查進(jìn)展了計數(shù)方法的驗證及控制菌檢查方法的驗證，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。1實驗材料黃連上清丸由山西萬輝制藥消費(fèi),批號為20220708，20220709，20220710。菌種包括枯草芽孢桿菌B63501、金黃色葡萄球菌B26003、大腸埃希菌B44102、白色念珠菌F98001、黑曲霉F98003，由北京生物制品檢定所提供1。培養(yǎng)基包括營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20220920、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基20220822、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基20220118、改進(jìn)馬丁液體培養(yǎng)基20220215、改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基20220125，均由北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司提供。2實驗方法2.1菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、大腸埃

6、希菌、枯草芽孢桿菌的新穎培養(yǎng)物至10L營養(yǎng)肉湯中，3537培養(yǎng)18h24h，取此培養(yǎng)液1L加0.9%無菌氯化鈉溶液9L，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-510-7，使菌數(shù)約為50100fu/L。接種白色念珠菌的新穎培養(yǎng)物至10L改進(jìn)馬丁液體培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)24h48h，取此培養(yǎng)液1L加0.9%無菌氯化鈉溶液9L，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410-5，使菌數(shù)約為50100fu/L。接種黑曲霉的新穎培養(yǎng)物至改進(jìn)馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，2328培養(yǎng)5d7d，加35L0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1L菌液加0.9%無菌氯化鈉溶液9L，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-410

7、-6，使菌數(shù)約為50100fu/L。以上菌液同時各取兩份注入培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用平皿計數(shù)法計數(shù)。結(jié)果見表1。2.2計數(shù)方法的驗證2.2.1供試品溶液的制備取供試品10g，參加0.9%無菌氯化鈉至100L，振搖，使成110的供試液。2.2.2黃連上清丸微生物限度檢查回收率測定進(jìn)展3次獨(dú)立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。試驗組：取供試液1L，參加1L菌液50100fu/L，注入培養(yǎng)基。菌液組：分別取菌液1L，注入培養(yǎng)基。供試品對照組：取供試液1L，注入培養(yǎng)基。稀釋劑對照組：取稀釋劑0.9%無菌氯化鈉1L，參加1L菌液50100fu/L，注入培養(yǎng)基。以上各組試驗均同時做兩份培養(yǎng)，且各試驗

8、菌同時進(jìn)展，采用平皿計數(shù)法。2.3控制菌檢查方法的驗證22.3.1大腸埃希菌32.3.1.1供試液的制備取供試品10g，參加0.9%無菌氯化鈉至100L，振搖均勻，使其成為110的供試液未經(jīng)高壓蒸汽滅菌。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.3.1.2驗證方法試驗組：取供試液10L，加到膽鹽乳糖培養(yǎng)基100L中，作為供試品管。同法重復(fù)1份，參加大腸埃希菌76fu作為陽性對照管。另取與供試液等量的稀釋劑加到膽鹽乳糖培養(yǎng)基100L中作陰性對照管。3537培養(yǎng)18h24h，取上述增菌液0.2L，參加5L的4-甲基傘形酮葡糖苷培養(yǎng)基UG試管中，置3537培養(yǎng)5h24h，觀察熒光，再參加靛基質(zhì)試劑觀察結(jié)果。陰性菌對

9、照組：采用革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌。驗證大腸埃希菌取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100L，按試驗組同法操作，其中參加金黃色葡萄球菌75fu做陰性對照管。3537培養(yǎng)18h24h，取上述增菌液0.2L，參加含5L的UG試管中，3537培養(yǎng)5h24h，觀察結(jié)果。2.3.2大腸菌群2.3.2.1供試液的制備取2.2.1項下的供試液1L，參加0.9%無菌氯化鈉9L，即為1100的供試液，取1100的供試液1L，參加0.9%無菌氯化鈉9L，即為11000的供試液。2.3.2.2驗證方法試驗組：取10L的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別參加110的供試液1L、1100的供試液1L、11000的供試液1L，作為供試品管。

10、同法重復(fù)1份，參加大腸埃希菌76fu作陽性對照管。另取與供試液等量的稀釋劑加到10L的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管中作陰性對照管。3537培養(yǎng)18h24h，觀察結(jié)果。陰性菌對照組：驗證大腸菌群，采用革蘭氏陽性球菌金黃色葡萄球菌，取10L的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，按試驗組同法操作，其中參加金黃色葡萄球菌75fu作陰性對照管。3537培養(yǎng)18h24h，觀察結(jié)果。2.4統(tǒng)計方法供試品計數(shù)方法的驗證檢查進(jìn)展3次獨(dú)立的平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率?？刂凭鷻z查方法的驗證采用與試驗組和陰性菌對照組同法的操作。3結(jié)果3.1黃連上清丸微生物限度檢查回收率測定結(jié)果見表2。由表可知該供試品對金黃色葡萄球菌

11、、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌的回收率均高于70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高于70%。3.2大腸埃希菌和大腸菌群控制菌檢查結(jié)果見表3，表4。由表可見控制菌檢查陽性菌生長良好，陰性菌均未檢出。4討論我們按照中國藥典2022年版微生物限度檢查法中常規(guī)法檢驗，首先將樣品進(jìn)展了細(xì)菌霉菌數(shù)測定，結(jié)果細(xì)菌數(shù)為4000fu/g，給方法學(xué)驗證帶來不便，故對制備好的供試液進(jìn)展了高壓蒸汽滅菌后再進(jìn)展計數(shù)方法的驗證。該供試品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌的回收率均高于70%，稀釋劑對5種試驗菌的回收率均高于70%，故本品無抑菌作用。按照中國藥典2022年版微生物限度檢查法進(jìn)展控制菌的方法學(xué)驗證試驗及檢查?？刂凭鷻z查陽性菌生長良好，說明本品對大腸埃希菌、大腸菌群沒有抑菌作用。陰性菌均未檢出，說明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。通過對本品的微生物限度檢查計數(shù)方法的驗證及控制菌檢查方法的驗證，在處方、消費(fèi)工藝及檢