降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)

1、降鈣素基因相關(guān)肽在局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)的表達(dá)【摘要】目的：討論GRP在大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷時(shí)表達(dá)狀況及其在損傷機(jī)制中的作用。方法：建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2小時(shí)再灌注24小時(shí)模型，分別采用TT染色及RT-PR法觀察大鼠腦組織缺血狀況及GRP的表達(dá)狀況。結(jié)果：假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)構(gòu)造正常GRP呈弱表達(dá)；模型組大鼠大腦缺血區(qū)組織明顯水腫，GRP表達(dá)較假手術(shù)組對(duì)應(yīng)區(qū)顯著升高，P0.05。結(jié)論：GRP參與了局灶性腦缺血再灌注損傷，且可能對(duì)缺血性腦損害起到一定的保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】局灶性腦缺血再灌注大腦中動(dòng)脈閉塞血紅素加氧酶AstudynexpressinandsignifianefSTAT

2、3inerebraltissuesfRatafterfalerebralisheiaandreperfusin【Abstrat】bjetiveTinvestigatetheeffetsftheexpressinfGRPinerebraltissuesfratafterfalerebralisheiaandreperfusin.ethds2hursrightintraluinaliddleerebralarterylusinithreperfusinasinduedin20rats,andthespeienfbrainereperfredatthepintafter24hursreperfusi

3、n;expressinsfGRPeredetetedbyRT-PRethd.ResultsExpressinsfGRPereseensparselyinthentrlspeiens,anderearklyinreasedafertransientfalerebalisheiaandreperfusin(p0.05)nlusinExpressinfGRPisasignifiantrespnsettransientfalerebralisheia/reperfusinandntributesttheearlyfrasinfvasgeniedeathatanbebservedallparstfbra

4、ins.【Keyrds】falerebralisheia;reperfusin;heexygenase缺血性腦血管疾病是一種致死致殘的常見(jiàn)并多發(fā)玻腦缺血再灌注損傷對(duì)腦損害的機(jī)制是非常復(fù)雜的。機(jī)制尚不非常清楚，更缺乏有效的治療方法。降鈣素基因相關(guān)肽GRP是由37個(gè)氨基酸組成的活性多肽，與降鈣素為同種基因產(chǎn)物，是目前的體內(nèi)最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)，廣泛分布在腦組織中1，在缺氧缺血的腦組織中具有有效的細(xì)胞保護(hù)作用。鑒于此，本研究旨在建立大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2h再灌注24h模型后，通過(guò)RT-PR法檢測(cè)大鼠腦組織GRPRNA表達(dá)的變化，討論GRP在腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的可能作用。1實(shí)驗(yàn)材料與方法1.1動(dòng)物來(lái)源與

5、分組北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)提供的SPF級(jí)雄性Sprague-Daley大鼠20只，體重260280g。將符合模型成功標(biāo)準(zhǔn)的大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組5只；缺血組15只。假手術(shù)組按下術(shù)模型制備。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1腦缺血模型A制備參照Z(yǔ)ea-lgue等復(fù)制局灶性腦缺血模型。將麻醉的大鼠仰臥位固定，頸正中切口，結(jié)扎并游離右側(cè)頸總、頸外動(dòng)脈，在游離段上接近頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處剪開(kāi)1小口，使4/0號(hào)外科尼龍線插入，經(jīng)過(guò)頸總動(dòng)脈分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈，入顱至大腦中動(dòng)脈起始處，線插入深度約為18.50.5。手術(shù)過(guò)程中保持環(huán)境在2530，且用棉墊和電烤燈維持大鼠體溫于3737.5，并一直保持至動(dòng)物麻醉清醒。造

6、模成功的標(biāo)準(zhǔn)：動(dòng)物手術(shù)后有明顯手術(shù)側(cè)即右側(cè)Hrner征右側(cè)眼瞼下垂，眼球凹陷及對(duì)側(cè)偏癱體癥不能完全伸展左前肢，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈2。依上述標(biāo)準(zhǔn)將可以存活24h的大鼠選定為最后的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，并進(jìn)展行為學(xué)評(píng)分。1.2.2取材再灌24小時(shí)后，在大鼠深度麻醉狀態(tài)下取腦，距大腦前端4處及后端3處冠狀取2厚的腦片，再迅速別離左右腦。用消毒好的錫箔紙包好右側(cè)受損腦組織，立即放入液氮中冰凍，然后取出凍存于70的冰箱中。切下的腦片迅速置于TT皿中進(jìn)展染色，來(lái)判斷腦損傷的程度。1.2.3缺血區(qū)腦組織STAT3的表達(dá)按Trizl液的說(shuō)明書(shū)提取總RNA。測(cè)定其濃度以及260n和280n處吸光度比值A(chǔ)260/280。

7、引物由大連寶生物工程合成，引物序列為：上游引物：5ATTGATGGATGTGATTTAATTA3；下游引物：5TAATGGGGAGGTAG3?？偡错戵w系12L，30反響10in，42反響30in，99反響5in，5反響5in，DNA產(chǎn)物置于20保存。取5L逆轉(zhuǎn)錄反響液進(jìn)展PR擴(kuò)增，反響條件為94變性30s，55退火30s，72延伸1in，擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物20保存。取PR產(chǎn)物5L經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，拍照并用光密度儀掃描分析。通過(guò)-atin光密度值進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)校正，計(jì)算GRPRNA的表達(dá)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用bandleaderver.3.0圖像分析軟件對(duì)PR電泳

8、圖像進(jìn)展分析，把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，再用SPSS13.0進(jìn)展統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)，P0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1腦缺血模型斷定造模大鼠清醒后即呈現(xiàn)腦缺血表現(xiàn)，均出現(xiàn)不同程度Hrner綜合征，左側(cè)前后肢癱，以前肢為重。3.2RT-PR結(jié)果RT-PR結(jié)果顯示,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)GRP和-atin分別為387bp和329bp兩條帶。缺血大鼠腦內(nèi)GRPRNA表達(dá)與假手術(shù)組有明顯差異(P0.05)(圖1)。假手術(shù)組與缺血24h組GRPRNA表達(dá)吸光度相對(duì)值(GRP/-atin)分別為:0.406、0.441、0.505、0.654、0.748、0.646。如圖1。降鈣素基因相關(guān)

9、肽是由37個(gè)氨基酸組成的活性多肽，具有擴(kuò)張腦血管3、減少腦組織缺血性損傷4，對(duì)缺氧的神經(jīng)元有保護(hù)和功能恢復(fù)等作用5。本實(shí)驗(yàn)中,首先TT染色結(jié)果顯示假手術(shù)組腦組織構(gòu)造正常；缺血再灌模型組大鼠缺血區(qū)腦組織明顯變白,說(shuō)明造模成功。其次,GRP在假手術(shù)組僅少量表達(dá),而缺血組大鼠腦組織GRP表達(dá)均較假手術(shù)組對(duì)應(yīng)區(qū)域顯著升高。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道GRP在腦組織中的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元有一定的的保護(hù)作用,但在缺血性腦損害中,GRP表達(dá)與其他應(yīng)激性蛋白質(zhì)在缺血性損害和修復(fù)過(guò)程中的機(jī)制及互相關(guān)系還不是很清楚，張?zhí)炝值?比擬海馬缺血及再灌流后現(xiàn),GRP含量與A1、A2、A3和A4區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)呈顯著性正相關(guān)。認(rèn)為腦缺血及再灌流后GR

10、P增加雖有可能增加腦供血,但也可能觸發(fā)再灌流損傷的發(fā)生,而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。因此GRP在腦缺血及再灌流中所起的作用較為復(fù)雜，有必要深化研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1KressA,TabitzD,SkfitshG,DetailedappingfGRPrnaexpressinintheratntralnervussyste:parisnithpreviusiunyt-heialfindings.BrainResBull1995,36(3):261.2atsuY,Izuiyaa,nderaH,etal.EffetfanvalthrbxaneA2reeptrantagnist,S-1452,npstisheiinjuryintats.Strde,1993,24:2059.3JhnstnFG,BellBA,RbertsnIJ,Effetfalitnin-gine-relatedpeptidenpstperativeneurlgialdefiitsaftersubarahnidhaerrhageJ.Lanet,1990,335:869872.4HllandJP,SydserffSG,TaylrAS,e