周?chē)窠?jīng)再生研究方法的進(jìn)展

1、周?chē)窠?jīng)再生研究方法的進(jìn)展【關(guān)鍵詞】周?chē)窠?jīng)損傷1常規(guī)周?chē)窠?jīng)再生檢測(cè)方法及現(xiàn)今開(kāi)展的方向神經(jīng)行為學(xué)及神經(jīng)電生理學(xué)。這兩種檢查方法簡(jiǎn)單方便，也是臨床上常用的檢測(cè)神經(jīng)再生的方法，但均是反響神經(jīng)功能的間接指標(biāo)，所以出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)間較晚，不能很好地及時(shí)地反響神經(jīng)真正的再生情況1、8?，F(xiàn)今研究神經(jīng)再生的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用組織形態(tài)學(xué)的檢查及利用示蹤劑進(jìn)展軸突的示蹤，從而能直接地觀察到神經(jīng)形態(tài)上變化，理解神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)情況，斷定神經(jīng)的再生程度。神經(jīng)再生從微觀來(lái)看，組織構(gòu)造上為軸突的再生，功能上為軸漿流運(yùn)輸?shù)幕謴?fù)，運(yùn)送神經(jīng)遞質(zhì)到靶器官；大體來(lái)講，神經(jīng)再生在構(gòu)造上為神經(jīng)纖維連續(xù)性的恢復(fù)，外形光滑完好，功能上為運(yùn)動(dòng)及

2、感覺(jué)的恢復(fù)。2傳統(tǒng)的組織形態(tài)學(xué)研究周?chē)窠?jīng)再生周?chē)窠?jīng)組織形態(tài)學(xué)研究的根底是神經(jīng)的解剖構(gòu)造。從解剖學(xué)上講神經(jīng)系統(tǒng)的根本構(gòu)造是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。神經(jīng)元由胞體和突起兩部分構(gòu)成，神經(jīng)元較長(zhǎng)的突起和其外表包被的構(gòu)造稱(chēng)為神經(jīng)纖維。較大的神經(jīng)元軸突常被附近的神經(jīng)膠質(zhì)或雪旺氏細(xì)胞卷繞包裹形成髓鞘，可保證軸突能高速傳導(dǎo)生物電信號(hào)。解剖上神經(jīng)元有長(zhǎng)短不等的軸突，軸突由軸索及外表的髓鞘構(gòu)成。軸突的外面由神經(jīng)內(nèi)膜覆蓋。軸索、髓鞘、神經(jīng)內(nèi)膜組成了完好的神經(jīng)纖維，多個(gè)神經(jīng)纖維組合在一起形成神經(jīng)束，外表包繞神經(jīng)束膜。多條神經(jīng)束形成神經(jīng)干，外表是神經(jīng)外膜。組織形態(tài)學(xué)檢查是對(duì)神經(jīng)再生構(gòu)造恢復(fù)的研究。研究神經(jīng)再生形態(tài)學(xué)傳統(tǒng)的方

3、法是對(duì)再生的神經(jīng)組織構(gòu)造直接染色成像。包括HE染色，乙酰膽堿酯酶染色，免疫組化染色(抗神經(jīng)絲單克隆抗體進(jìn)展標(biāo)記，然后呈色反響)，甲苯胺藍(lán)染色等。采用HE染色(蘇木精-伊紅)染色方法，直接觀察再生神經(jīng)的有髓纖維(軸突)的數(shù)目；乙酰膽堿酯酶染色，可以區(qū)分運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)纖維軸突數(shù)；抗神經(jīng)絲單克隆抗體進(jìn)展標(biāo)記，然后呈色反響、免疫組化染色，直接觀察再生的神經(jīng)纖維10。傳統(tǒng)的方法是對(duì)再生神經(jīng)組織構(gòu)造的靜態(tài)研究，可以通過(guò)染色直接觀察再生的神經(jīng)纖維及軸突的形態(tài)及數(shù)目8，1719。3通過(guò)神經(jīng)示蹤劑進(jìn)展軸突示蹤研究周?chē)窠?jīng)的再生研究神經(jīng)再生的根底是神經(jīng)軸漿流的運(yùn)輸。神經(jīng)元產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸至軸突及其分支以維持其代

4、謝，在神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽及合成經(jīng)典遞質(zhì)的酶也需在胞體合成；從末梢也有影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體，這種運(yùn)輸現(xiàn)象稱(chēng)為軸漿(突)運(yùn)輸。軸突運(yùn)輸是反映神經(jīng)構(gòu)造、功能和代謝完好性的重要指標(biāo)。周?chē)窠?jīng)損傷段軸漿流運(yùn)輸?shù)幕謴?fù)是神經(jīng)再生的最初證據(jù)8。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的研究神經(jīng)再生的方法是利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的示蹤法，也就是動(dòng)態(tài)研究神經(jīng)再生的情況。神經(jīng)示蹤劑通過(guò)順行及逆行運(yùn)輸用來(lái)研究軸突的傳導(dǎo)途徑，研究神經(jīng)元之間的纖維聯(lián)絡(luò)及神經(jīng)再生的情況?，F(xiàn)有的研究再生神經(jīng)軸突運(yùn)輸，神經(jīng)形態(tài)學(xué)的檢測(cè)方法歸納如下。3.1辣根過(guò)氧化物酶示蹤技術(shù)(HRP示蹤)HRP被神經(jīng)組織攝入后，順向或逆向運(yùn)輸，然后用組織化學(xué)方

5、法顯示HRP的運(yùn)輸結(jié)果為HRP示蹤。辣根過(guò)氧化物酶能被神經(jīng)末梢攝取，經(jīng)周?chē)窠?jīng)的軸突運(yùn)輸，并參與神經(jīng)細(xì)胞的代謝。HRP注入肌肉被神經(jīng)末梢攝取后，經(jīng)軸漿逆流可以通過(guò)神經(jīng)縫合口到達(dá)神經(jīng)近段；HRP也可以被胞體攝入并順向送至終末部。常規(guī)的HRP示蹤為聯(lián)苯胺法或TB法。將HRP注射到神經(jīng)的一定部位，經(jīng)過(guò)固定及切片，用聯(lián)苯胺法顯示標(biāo)記的結(jié)果。由于HRP參與細(xì)胞代謝，所以缺點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)存留的時(shí)間短15，20。3.2放射性核素示蹤(放射性核素標(biāo)記氨基酸或HRP)(1)實(shí)驗(yàn)選用發(fā)射射線(xiàn)的125I為標(biāo)記物，標(biāo)記酪氨酸酪氨酸參與神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)代謝，將標(biāo)記的酪氨酸直接注入神經(jīng)干內(nèi)，標(biāo)本以-計(jì)數(shù)器進(jìn)展測(cè)量，方法簡(jiǎn)便，

6、為將降臨床應(yīng)用131I進(jìn)展檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基矗實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在大鼠坐骨神經(jīng)干內(nèi)注射125I-酪氨酸，隨著軸漿流的運(yùn)輸通過(guò)神經(jīng)吻合口。放射性核素標(biāo)記的氨基酸是軸漿流體內(nèi)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)研究較好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＞哂袠?biāo)記方法簡(jiǎn)便、可靠，注射方法簡(jiǎn)單，吸收時(shí)間和轉(zhuǎn)運(yùn)速率均適中的優(yōu)點(diǎn)1。實(shí)際上，隨著同位素標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步和同位素檢測(cè)設(shè)備的改善，對(duì)微量放射性已能檢測(cè)，進(jìn)展同位素標(biāo)記物質(zhì)隨軸漿流轉(zhuǎn)運(yùn)的體內(nèi)檢測(cè)也已有可能，并有可能成為臨床上檢測(cè)神經(jīng)再生的重要手段。3.3順行示蹤技術(shù)(生物素葡聚糖胺BDA、病毒追蹤法)BDA追蹤法的優(yōu)點(diǎn)：能長(zhǎng)間隔 運(yùn)輸，可雙向運(yùn)輸，因此部分注射后有利于觀察結(jié)果。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的解剖學(xué)研究中，B

7、DA染色能非常明晰地顯示軸突，反響程序簡(jiǎn)單，靈敏度高。BDA染色后，可與熒光追蹤劑結(jié)合使用，便于在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡(LS)下觀察。BDA與卵白素(阿維丁，avidin)之間有特別強(qiáng)的親和力，常用結(jié)合過(guò)氧化物酶或熒光素的avidin與之孵育結(jié)合，通過(guò)組化反響或熒光顯微鏡觀察標(biāo)記結(jié)果。葡聚糖用于順行追蹤時(shí)能充分顯示軸突及其分支8。通過(guò)大鼠的實(shí)驗(yàn)研究，10BDA可明晰地在周?chē)窠?jīng)軸突內(nèi)顯像，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果易于觀察。BDA神經(jīng)干部分注射后能較清楚而直觀地顯示部分軸突運(yùn)輸?shù)那闆r。BDA注射點(diǎn)：經(jīng)DAB顯色見(jiàn)標(biāo)記陽(yáng)性的神經(jīng)纖維呈褐紫色標(biāo)記，有髓神經(jīng)纖維較粗。共聚焦顯微鏡觀察，BDA注射點(diǎn)見(jiàn)髓鞘熒光

8、信號(hào)較強(qiáng)，髓鞘被均勻染色，高倍鏡下部分注射點(diǎn)處的神經(jīng)纖維縱切片可見(jiàn)神經(jīng)纖維的軸突、髓鞘、神經(jīng)被膜均有明顯的熒光標(biāo)記。髓鞘染色，軸突亦染色，髓鞘與軸突界限明顯。其標(biāo)記物主要位于軸突且標(biāo)記明顯，而髓鞘的標(biāo)記不明顯5。3.4熒光素示蹤(熒光素，熒光金)可以和HRP、免疫組化等方法結(jié)合3.4.1熒光劑示蹤神經(jīng)纖維進(jìn)展示蹤研究的過(guò)程中，人們使用過(guò)多種染料，如DiI、快藍(lán)、熒光金等。熒光金在波長(zhǎng)為323n的紫外光激發(fā)下，可發(fā)出波長(zhǎng)為408n的黃色熒光，且具有靈敏度高、運(yùn)輸和標(biāo)記的間隔 長(zhǎng)，標(biāo)記細(xì)胞漿的同時(shí)不標(biāo)記細(xì)胞核，可耐受多種組織染色處理的特性，被越來(lái)越多地應(yīng)用于逆行示蹤的研究。同時(shí)對(duì)軸突也有很好的標(biāo)記

9、效果。分布均勻，呈線(xiàn)性熒光，有利于對(duì)軸突形態(tài)的直接觀察。FG(熒光金)可在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存留，不能跨突觸運(yùn)輸?，F(xiàn)有學(xué)者用熒光金逆行示蹤技術(shù)評(píng)價(jià)大鼠正常及視神經(jīng)不完全損傷后的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinalganglinells,RGs)的數(shù)目7。DiI、快藍(lán)等染料在神經(jīng)再生的示蹤中在國(guó)外的文獻(xiàn)中也有大量報(bào)導(dǎo)9，12，13。3.4.2熒光雙標(biāo)通過(guò)熒光雙標(biāo)研究神經(jīng)吻合后軸突再生的情況，討論神經(jīng)端側(cè)吻合后軸突再生的來(lái)源，及供神經(jīng)外膜開(kāi)窗與否對(duì)軸突再生的影響。將2種不同的熒光素(FB、NY)分別注入端側(cè)吻合遠(yuǎn)側(cè)的供、受神經(jīng)內(nèi)，通過(guò)軸漿逆行運(yùn)輸?shù)焦┥窠?jīng)的神經(jīng)元，F(xiàn)B標(biāo)記胞漿，NY標(biāo)記胞核。由于NY是注射到受

10、神經(jīng)，只要供神經(jīng)的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的胞核被標(biāo)記，就說(shuō)明供神經(jīng)的軸突長(zhǎng)入于受神經(jīng)。只要供神經(jīng)的胞核、胞漿均被標(biāo)記，就說(shuō)明有供神經(jīng)側(cè)枝發(fā)芽長(zhǎng)入受神經(jīng)。因此，胞核單標(biāo)記或胞核、胞漿雙標(biāo)記，對(duì)證明供神經(jīng)軸突長(zhǎng)入受神經(jīng)，在意義上是一樣的16。3.4.3與免疫組化等方法結(jié)合例如AB法，結(jié)合HRP復(fù)合物或FIT(異硫氰酸熒光素)等熒光素的抗生物素與生物素有很強(qiáng)的親和力，反響后進(jìn)展標(biāo)記，可以與BDA法相結(jié)合應(yīng)用8。3.5分子神經(jīng)生物學(xué)方法通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的LaZ基因靶向性導(dǎo)入脊髓及示蹤周?chē)窠?jīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。由損傷的周?chē)窠?jīng)導(dǎo)入的AdLaZ不但在靶神經(jīng)元高效特異性表達(dá)，而且能高效順行標(biāo)記神經(jīng)元突起、周?chē)窠?jīng)直至吻合口遠(yuǎn)端

11、的再生軸突，這對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷的基因治療和神經(jīng)示蹤研究有實(shí)用價(jià)值。也是反響神經(jīng)軸突運(yùn)輸?shù)膭?dòng)態(tài)過(guò)程6。4在體微創(chuàng)周?chē)窠?jīng)再生研究由于行為學(xué)及電生理的檢測(cè)不夠準(zhǔn)確、及時(shí)，神經(jīng)形態(tài)學(xué)及神經(jīng)軸漿流的一些示蹤檢查都需要切取組織切片檢查，這些研究對(duì)于臨床觀察神經(jīng)再生不實(shí)用，離作者的目的還差很遠(yuǎn)。所以出現(xiàn)了一些對(duì)于神經(jīng)再生進(jìn)展無(wú)創(chuàng)的在體實(shí)驗(yàn)研究，包括以下幾個(gè)方面：1以131I-酪氨酸在神經(jīng)內(nèi)的在體示蹤顯像，結(jié)合99T-DP骨顯像選用131I酪氨酸和99T2亞甲基二膦酸鹽(DP)，通過(guò)計(jì)算機(jī)圖像交融，在兔動(dòng)物模型中，分別對(duì)正常坐骨神經(jīng)及移位后膈神經(jīng)進(jìn)展軸漿流核素顯像。結(jié)果說(shuō)明正常兔坐骨神經(jīng)內(nèi)軸漿流轉(zhuǎn)運(yùn)速率為每天

12、30，膈神經(jīng)移位術(shù)后1個(gè)月即可在再生良好組織中測(cè)出131I酪氨酸通過(guò)吻合口向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)運(yùn)速率為每天40。在瘢痕組中發(fā)現(xiàn)131I酪氨酸不能向遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)運(yùn)。131I酪氨酸在神經(jīng)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)可用于在體示蹤顯像，與99T2DP圖像交融可對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)圖像進(jìn)展定位，可在術(shù)后早期在體直觀檢測(cè)軸漿流通過(guò)神經(jīng)吻合口的才能。但不能得到神經(jīng)纖維滿(mǎn)意的圖像2。2經(jīng)皮在解剖熒光顯微鏡下可觀察轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)大鼠表達(dá)熒光蛋白的皮神經(jīng)的形態(tài)及再生的情況10，11。3美國(guó)最新的神經(jīng)再生方面在體研究是通過(guò)神經(jīng)纖維部分注射熒光劑，然后利用微導(dǎo)管共聚熒光顯微鏡直接觀察神經(jīng)纖維的圖像，理解周?chē)窠?jīng)再生的部分情況。為了更加準(zhǔn)確地反響周?chē)窠?jīng)功能的恢復(fù)情況，實(shí)驗(yàn)同時(shí)增加功能核磁的觀測(cè)大腦皮層指標(biāo)來(lái)反響神經(jīng)系統(tǒng)總體的恢復(fù)情況也就是間接地反響了神經(jīng)功能的恢復(fù)。這兩種檢測(cè)方法結(jié)合到一起，既有解剖上的觀察，又有功能上的檢測(cè)，可以更全面客觀地反響神經(jīng)再生的情況，而且將檢查的損傷降到最低程度。但此研究仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段14。近年來(lái)對(duì)周?chē)窠?jīng)再生的研究雖然獲得了重大的進(jìn)展，可以通過(guò)神經(jīng)軸漿流的運(yùn)輸較早地準(zhǔn)確地反映神經(jīng)再生的情況