針對HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對HBVx基因表達的抑制

1、針對HBVx基因的siRNA重組腺病毒的制備及其對HBVx基因表達的按捺秦煒煒，劉家云，張瑞，王濤，王凱，孟艷玲，楊安鋼【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；,RNA滋擾；,腺病毒；,基因治療PreparatinfrebinantadenvirusediatedsiRNAtargetingHBVxgeneanditssuppressiveeffetnHBVxgeneexpressin【Keyrds】hepatitisBvirus;RNAinterferene;adenvirus;genetherapy【摘要】目的：構(gòu)建針對乙型肝炎病毒x基因HBx基因的小滋擾RNA(siRNA)重組腺病毒表達載體，并在能表達

2、HBx基因的人肝癌細胞株HepG2中不雅察其對HBx基因表達的按捺作用.要領(lǐng)：重組腺病毒穿梭載體pShuttleHBx與骨架載體在大腸桿菌BJ5183中同源重組得到重組腺病毒載體，后者轉(zhuǎn)染HEK293細胞，包裝并擴增出病毒顆粒.用得到的病毒熏染能表達HBx基因人肝癌細胞株HepG2，網(wǎng)絡(luò)細胞總RNA和總卵白，接納RTPR和esternBlt要領(lǐng)檢測細胞中HBx基因表達的變革.結(jié)果：經(jīng)限定性內(nèi)切酶酶切斷定，證明針對HBx基因的siRNA重組腺病毒載體構(gòu)建樂成.RTPR和esternBlt要領(lǐng)證明，在HepG2細胞中，HBx基因在RNA和卵白水均勻有低落.結(jié)論：腺病毒介導的針對HBx基因的siRN

3、A在體外可以或許高效、特異地按捺HBx基因的表達.【關(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；RNA滋擾；腺病毒；基因治療0弁言乙型肝炎病毒hepatitisBvirus,HBV基因組中，HBx基因編碼的HBX卵白是HBV編碼卵白中唯一具有多種調(diào)控成效的病毒卵白質(zhì)1-2，可以激活宿主細胞中受損DNA的修復(fù)3-4，而且同多種腫瘤相干分子有彼此作用.因此以為，HBX與肝細胞肝癌的產(chǎn)生和生長嚴密相干.RNA滋擾(RNAinterferene,RNAi)是雙鏈RNA(dublestrandRNA,dsRNA)介導的、序列特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默沉靜psttransriptinalgenesilening,PTGS征象，其重要

4、生物學成效在于對抗病毒熏染，維持基因組中轉(zhuǎn)座子的不變性，掃除非常RNA，并到場基因表達的調(diào)控5-6.我們構(gòu)建針對HBx基因重組腺病毒干預(yù)干與載體，在人肝癌細胞株HepG2中檢測其對HBx基因表達的按捺結(jié)果，為乙型肝炎病毒熏染以及熏染后產(chǎn)生的肝細胞肝癌的基因治療提供新思緒.1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料含有針對HBx基因的兩個干預(yù)干與靶序列的干預(yù)干與表達質(zhì)粒pSUPERHBx2，pSUPERHBx5干預(yù)干與序列別離針對HBx基因的301319位和198216位，表達HBx基因的質(zhì)粒pNDA3.1HBxy，比較載體AdeasyH1，pDNA3EGFP，大腸埃希菌DH5，HEK293細胞以及人肝癌細胞Hep

5、G2第四軍醫(yī)大門生物化學與分子生物學教研室.pAdeasy1腺病毒重組體系Stratgene公司；限定性內(nèi)切酶XbaI，HindIII和T4DNA毗連酶TaKaRa公司；限定性內(nèi)切酶PaI和PeINeEnglandBilab公司；質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠接納試劑盒合胖優(yōu)晶生物技能；HDE造就基和RPI1640造就基Hylne公司；胎牛血清杭州四序青公司；LipfetAineT2000，RTPR試劑盒和TRIZLT試劑Invitrgen公司；y標簽,EGFP多克隆抗體Santaruz公司；兔抗人atin多克隆抗體和辣根酶(HRP)標識表記標幟的山羊抗兔二抗武漢博士德公司；EL化學發(fā)光試劑盒為Pier

6、e公司.用于擴增HBx基因的上游引物：5TTTAAGTTATGGTGTAGGTGTGTG3，卑劣引物：5TTTGGTATTAGGAGAGGTGAAAAAGTTG3；用于擴增內(nèi)參照atin基因的上游引物:5TGGAGAAAAAAGATGAGATT3,卑劣引物:5TGGGGGAAAAAAGGGGGAAGG3；用于擴增EGFP基因的上游引物：5ATGAGGGGGAAGAG3，卑劣引物：5GGTGTTTGGTTTT3,上述引物由北京三博遠志生物技能合成.1.2要領(lǐng)經(jīng)XbaI和HindIII雙酶切反響，從pSUPERHBx2，pSUPERHBx5質(zhì)粒獵取RNAi表達框片斷HBx2和HBx5巨細300bp

7、擺布，將兩目的片斷接納后亞克隆入同樣經(jīng)XbaI和HindIII雙酶切的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle，卡那霉素選擇性造就基挑選陽性克隆，提取質(zhì)粒，用XbaI和HindIII雙酶切，10L/L瓊脂糖凝膠電泳斷定.得到含小滋擾RNA(shrtinterferingRNA,siRNA)表達框的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5.將pShuttleHBx2，pShuttleHBx5質(zhì)粒用PeI酶切線性化，與pAdeasy1按101的比例電轉(zhuǎn)化至BJ5183感覺態(tài)細菌.卡那霉素選擇性造就基挑選陽性克隆，挑取較小的克隆擴增造就，提取質(zhì)粒.用PeI酶切斷定質(zhì)粒，將斷定準確的重組

8、質(zhì)粒再次轉(zhuǎn)化DH5感覺態(tài)細胞，擴增陽性克隆并大量提取質(zhì)粒，得到含針對HBx干預(yù)干與表達框的重組腺病毒質(zhì)粒.陰性比較質(zhì)粒AdeasyH1為帶有H1啟動子的pAdShuttle質(zhì)粒，用PeI酶切線性化后與pAdeasy同源重組得到.包裝細胞造就：含100L/L胎牛血清的HDE造就基，37，50L/L2造就箱中造就HEK293細胞，當細胞會合度達70%80%時轉(zhuǎn)染.重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細胞：重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5用PaI酶切線性化后接納，根據(jù)LipfetAineT2000說明書轉(zhuǎn)染6孔造就板中的HEK293細胞，37，50L/L2造就箱中孵育，1012d后網(wǎng)

9、絡(luò)細胞，液氮與37兩個溫度下重復(fù)凍融4次，裂解細胞以勞績原始病毒，病毒熏染HEK293細胞使病毒大量擴增.重復(fù)上述步調(diào)，終極網(wǎng)絡(luò)3輪擴增的病毒液，分裝保存于-70.病毒滴度的測定：用TID法檢測病毒滴度后，得到11010pfu/L的病毒事情液.重組腺病毒對HBx基因RNA的落解作用制備的重組腺病毒熏染人肝癌細胞株HepG2，同時轉(zhuǎn)染表達HBx基因的質(zhì)粒pNDA3.1HBxy和pDNA3EGFP，后者用來監(jiān)測各組轉(zhuǎn)染服從，比較組轉(zhuǎn)染只含有H1啟動子的質(zhì)粒AdeasyH1.37，50L/L2造就箱中孵育，48h后，別離網(wǎng)絡(luò)細胞總RNA和卵白.通過RTPR檢測HepG2細胞HBx轉(zhuǎn)錄程度的變革：提取

10、實行組和比較組HepG2細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，取5g總RNA根據(jù)SuperSriptT說明書舉行DNA第一鏈的合成，以反轉(zhuǎn)錄得到的DNA為模板在PE2400型DNA擴增儀上舉行PR反響.HBxPR條件為：95變性5in，再9530s，5730s，7230s，共30個循環(huán)，末了72延伸5in.反響產(chǎn)物為HBx基因片斷，長度為464bp；內(nèi)參照atin基因擴增條件為：95變性3in后，9530s，5530s，7245s，共20個循環(huán)，末了72延伸5in，擴增片斷巨細為438bp；EGFP基因PR反響參數(shù)為：95變性5in，再9530s，5845s，7230s，共27個循環(huán)，

11、末了72延伸5in，反響產(chǎn)物為538bp.10L/L瓊脂糖凝膠電泳斷定，比力干預(yù)干與組與比較組RNA程度表達差異.重組腺病毒對HBX卵白表達的影響用100L的細胞裂解液裂解上述各組細胞，410000g離心20in，網(wǎng)絡(luò)上清液，參加等量2SDSLadingBuffer，煮沸5in,每孔上樣30L，卵白樣品經(jīng)SDSPAGE分散后，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上.依次參加5g/L脫脂奶粉室溫關(guān)閉2h，1200y標簽抗體和EGFP抗體室溫孵育2h，12000的HRP酶標羊抗兔二抗室溫孵育1h.用TBST緩沖液洗滌后，參加底物發(fā)光劑EL1L，反響5in后吸干發(fā)光劑，用單層透明薄膜包裹后曝光,X光膠片顯影.2結(jié)果

12、2.1pShuttleHBx2，pShuttleHBx5載體的斷定用XbaI和HindIII雙酶切構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttleHBx2和pShuttleHBx5，得到6300bp及300bp擺布的片斷圖1，與預(yù)期巨細同等,證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建樂成.2.2pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5載體的斷定用PeI別離酶切重組質(zhì)粒pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5，得到23000bp和4300bp兩個片斷圖2，結(jié)果與預(yù)期同等，證明骨架質(zhì)粒同源重組樂成.2.3重組pAdeasyHBx2，pAdeasyHBx5腺病毒的包裝含重組腺病毒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細胞HEK293，造就1k后，顯

13、微鏡下可見特性性圓球狀及葡萄串樣聚合的細胞病理性改變；電鏡下可見病毒熏染后的死細胞，胞體腫脹，胞膜不完備，細胞內(nèi)布滿病毒顆粒圖3A，圖中箭頭所示即為病毒顆粒,以及熏染細胞的胞核，內(nèi)有成堆的病毒顆粒圖3B，圖中箭頭所示為病毒顆粒.第10日，可見大部門包裝細胞腫脹脫落，細胞出現(xiàn)細胞病理反響ytpathlgialeffet，PE樣變革.A：病毒熏染的包裝細胞4000；B：包裝細胞胞質(zhì)內(nèi)的病毒顆粒40000.2.4共轉(zhuǎn)HepG2細胞不雅察HBx基因表達環(huán)境包裝完成的病毒顆粒以30I熏染人肝癌細胞株HepG2，48h后，別離網(wǎng)絡(luò)細胞總RNA和卵白，檢測其變革.RTPR結(jié)果表白，與未處置懲罰組和轉(zhuǎn)染空載體

14、組細胞相比，熏染腺病毒組細胞的HBx基因RNA量顯著低落圖4A；esternBlt結(jié)果表現(xiàn)，熏染腺病毒可使細胞HBX卵白的表達量明顯淘汰圖4B.3討論如今，在我國普及應(yīng)用的抗HBV藥物重要有兩類，即滋擾素和核苷類藥物如拉米夫定等.但療效均不抱負，新型有用的抗HBV藥物仍在探究中.RNAi用于HBV治療在理論上具有以下長處7：特異性落解HBVRNA，從而制止病毒復(fù)制，對已整合入宿主細胞基因組的前病毒及無復(fù)制活性的病毒，RNAi也可以起到有用的按捺作用，這是通?？共《舅師o可相比的.其次，RNAi可以針對病毒基因守舊區(qū)發(fā)揮作用，從而限定病毒產(chǎn)生躲避突變株的本領(lǐng).因此，RNAi技能為各種慢性HBV熏染

15、開發(fā)了新的途徑.有學者以為RNAi技能應(yīng)用于抗HBV治療，有望成為治療乙型肝炎的革命性新要領(lǐng)，將有宏大的社會代價8.腺病毒載體是如今基因治療研究和臨床試驗中應(yīng)用最普及的病毒載體之一.由于腺病毒載體宿主范疇廣，熏染服從高，可插入外源基因片斷大，可介導外源基因短時呈高程度表達和不整合到熏染細胞的基因組中等特點9.在本實行中，我們接納He等10創(chuàng)立的pAdeasy腺病毒載體體系，通過細菌體內(nèi)同源重組的要領(lǐng)，構(gòu)建針對HBVx基因的兩個差異位點的siRNA重組腺病毒載體.該要領(lǐng)不單發(fā)揮了重組腺病毒高效、寧靜等長處，同時，還具有重組服從高，包裝時間短等特點.腺病毒載體介導的RNA滋擾落服了以往用質(zhì)粒作為s

16、iRNA運送載體轉(zhuǎn)染服從低的缺陷.實行中我們利用RTPR,esternBlt的要領(lǐng)在RNA水安然平靜卵白質(zhì)程度證明針對HBx基因的siRNA重組腺病毒有用地按捺了HBx基因的表達.本實行表白腺病毒是一種有應(yīng)用遠景的抗HBV熏染的基因治療載體，其可為慢性HBV熏染以及HBV熏染后產(chǎn)生的肝細胞肝癌的基因治療提供新思緒.【參考文獻】1BirrerRB,BirrerD,KlavinsJV,etal.HepatellulararinaandhepatitisvirusJ.AnnlinLabSi,2022,33(1):39-54.2HangGY,LinY,HuangL,etal.Detetinfthehe

17、patitisBvirusXprtEin(HBX)antigenandantiHBXantibdiesinasesfhuanhepatellulararinaJ.Jlinirbil,2022,11(12):5598-5603.3TangH,DelgeraaL,HuangF,etal.ThetransriptinaltransativatinfuntinfHBxprteinisiprtantfritsaugentatinrleinhepatitisBvirusrepliatinJ.JVirl,2022,79(9):5548-5556.4彭紹華,厲浩,鄧紅,等.HBx卵白和p53卵白對細胞凋亡的調(diào)治及其在肝細胞癌產(chǎn)生中的作用J.腫瘤防治雜志,2022,108:792-794.5NvinaD,SharpPA.TheRNAirevlutinJ.Nature,2022,430:161-164.6DrsettY,TushlT.siRNAs:AppliatinsinfuntinalgenisandptentialastherapeutisJ.NatRevDrugDisv,2022,3:318-329.7ShlaiA,ShaulY.InhibiyinfhepatitisBvirusexpressinandrepliatinb