成人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)

1、成人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)關(guān)鍵字：成骨細(xì)胞堿性磷酸酶骨鈣素膠原摘要：目的：改進(jìn)成人成骨細(xì)胞消化培養(yǎng)方法，以滿足在細(xì)胞學(xué)程度進(jìn)展骨代謝性疾病研究的需要。方法：取無菌骨碎片，先用胰蛋白酶消化屢次，以去除血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后，再次使用胰蛋白酶消化，得到大量純潔成骨細(xì)胞。細(xì)胞長至集合后生成黑色結(jié)節(jié)。分別采用npp底物法、125i標(biāo)記放射免疫(ria)法和型膠原順序沉淀抽提、sdspage復(fù)原電泳法測定細(xì)胞上清中成骨細(xì)胞主要特征性分泌物：大量堿性磷酸酶(akp)、骨鈣素(n)和型膠原。結(jié)果：黑色結(jié)節(jié)經(jīng)四環(huán)素染色，熒光顯微鏡下觀察為骨結(jié)節(jié)特征性的金黃色。成骨細(xì)胞上清中akp分泌量為(2.760.

2、56)iu/l、n分泌量為(1.8750.549)ng/l，明顯高于成纖維細(xì)胞(p0.01)?？蓹z測到型膠原而無型膠原。結(jié)論：此改進(jìn)方法可以在短期內(nèi)得到大量性狀穩(wěn)定成骨細(xì)胞，同時防止成纖維細(xì)胞混入。關(guān)鍵詞：成骨細(xì)胞堿性磷酸酶骨鈣素膠原成骨細(xì)胞特征性表型為分泌骨鈣素(n)、大量堿性磷酸酶(akp)和型膠原而無型膠原分泌1。我們采用改進(jìn)骨組織消化培養(yǎng)方法，將骨片經(jīng)短期培養(yǎng)后再用胰蛋白酶消化加快骨細(xì)胞的釋放。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及特征性分泌物檢測證實獲得成骨細(xì)胞數(shù)量多，并與纖維細(xì)胞有明顯區(qū)別。材料與方法一、液體的配制0.25%胰蛋白酶用trypsin(1:250difdetritihigan)溶解于d-ha

3、nks液，抽濾滅菌。培養(yǎng)液使用de+haf1211混合液(gibbrlgrandislandny)加20%滅活新生牛血清、青霉素100u/l、鏈霉素100g/l。低血清培養(yǎng)液為5%滅活新生牛血清，其余同培養(yǎng)液。使用252培養(yǎng)瓶(nunlndenark)。二、骨組織片消化取骨科手術(shù)中獲得的無菌骨碎片徹底去除骨膜及軟組織；用無菌hanks液沖洗3次剪碎至體積小于13；hanks液屢次沖洗至骨片發(fā)白放入錐形瓶內(nèi)參加0.25%胰蛋白酶(骨碎片10倍體積)37水浴中消化(30in5)去掉上清。剩余骨片浸泡于培養(yǎng)液中置372培養(yǎng)箱內(nèi)23d后吸出培液參加0.25%胰蛋白酶37水浴中消化30in上清液經(jīng)尼龍網(wǎng)

4、過濾后離心10in(1000r/in)去掉上清液沉淀物用培養(yǎng)液打勻接種于252培養(yǎng)瓶內(nèi)重復(fù)3次直至離心后無沉淀物為止。將消化后的骨片浸泡于培養(yǎng)液中23d后重復(fù)上述胰蛋白酶消化步驟仍有細(xì)胞釋放根據(jù)所需細(xì)胞量可重復(fù)數(shù)次。接種后培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液較渾濁10h后即有貼壁細(xì)胞72h后細(xì)胞完全貼壁可沖洗、換液。此后隔日換液。取第二、三代細(xì)胞，消化后，以1105/l濃度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4l5d后換低血清培養(yǎng)液6l，24h后搜集上清液，分裝于5個離心管內(nèi)，-18保存用于檢測。三、成骨細(xì)胞特征性鑒定以皮膚成纖維細(xì)胞作為對照，鑒定實驗所得成骨細(xì)胞。1.形態(tài)學(xué)觀察:除常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察外，采用趨骨性熒光素標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)生

5、成結(jié)節(jié)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)參加四環(huán)素使終濃度為50g/l培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h換新穎培養(yǎng)液培養(yǎng)1h，經(jīng)hanks液沖洗3次乙醇梯度脫水固定lypus-vanx-t顯微鏡落射熒光觀察。2.成骨細(xì)胞上清液akp檢測:采用磷酸對硝基苯酯二鈉鹽(p-nitrphenylphsphatedisdiusaltnpp上海麗珠東風(fēng)公司)比色法2無色p-npp與akp在37水浴中反響生成黃色對硝基苯p-nitrphenl經(jīng)405n波長比色測得d值換算成國際單位。3.成骨細(xì)胞上清液中骨鈣素檢測:采用bgp放免試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所)檢測3。根據(jù)放射免疫競爭結(jié)合原理，125i標(biāo)記n和樣品所含n與n抗體競爭結(jié)合，使用別離

6、劑使結(jié)合抗體沉淀，4離心后，計數(shù)器測定沉淀物p數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品曲線得到樣品n含量。4.成骨細(xì)胞上清液中膠原抽提及檢測:采用中性、酸性nal溶液順序沉淀抽提4，sds垂直板復(fù)原電泳法2。配制7.5%-0.2%bis聚丙烯酰胺凝膠板固定于垂直板電泳槽5。電泳液為0.05tris、0.38甘氨酸、0.01%sds(ph=8.8)；樣品液為0.125tris、15%甘油、2尿素、2%sds、0.001%溴酚蘭；染色液為0.25%考馬斯亮藍(lán)r250、25%異丙醇和10%ha；脫色液為5%異丙醇和8%ha。樣品解凍后放55水浴中變性1h參加樣品緩沖液50l每個樣品點2孔每孔加樣20l另加型膠原標(biāo)準(zhǔn)品50a恒

7、定電流電泳1h后每個樣品第1孔內(nèi)參加100l20%巰基乙醇(-eraptethanl，siga)樣品緩沖液靜置1h后13a恒定電流電泳12h染色液染色1h脫色液脫色24h拍照片。四、統(tǒng)計方法使用statpal軟件包對所得數(shù)據(jù)進(jìn)展t檢驗。結(jié)果1形態(tài)學(xué)觀察：骨組織消化后所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，10h后開場有梭形貼壁細(xì)胞；72h后細(xì)胞全部貼壁并伸出生長突，可見細(xì)胞呈梭形或鱗片狀生長細(xì)胞外表分泌物較多；1周后細(xì)胞開場呈現(xiàn)成骨細(xì)胞形態(tài)多數(shù)呈鱗片形體積較大多偽足胞漿豐富胞核較大偏于一側(cè)有23個核仁6，7一般24周至集合；繼續(xù)培養(yǎng)可見部分多層生長并有黑色結(jié)節(jié)生成。經(jīng)四環(huán)素標(biāo)記熒光顯微鏡觀察為金黃色亮區(qū)證實為骨

8、結(jié)節(jié)。透射電鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞體積較大長方形或方形，約40胞漿豐富內(nèi)含大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，呈旺盛分泌相。2成骨細(xì)胞上清中akp檢測：24h成骨細(xì)胞上清中，akp分泌量為(2.760.56)u/l，高于成纖維細(xì)胞分泌量(1.960.23)u/l。兩者相比，差異有顯著性意義(p0.01)。3成骨細(xì)胞上清中骨鈣素檢測：24h成骨細(xì)胞上清中，n分泌量為(1.8750.549)ng/l，亦高于成纖維細(xì)胞分泌量(1.1900.591)ng/l，差異有顯著性意義(p0.01)。4膠原檢測：成骨細(xì)胞有大量型膠原分泌無型膠原分泌；成纖維細(xì)胞型膠原均有分泌。討論一、成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的建立早在20世紀(jì)60年代pek和

9、birge8開場用膠原酶消化骨片體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞獲得成功；1975年ng等9采用屢次膠原酶消化使培養(yǎng)的成骨細(xì)胞得到純化。1985年rbey和terin等10采用低a2+培養(yǎng)液培養(yǎng)骨片獲得成骨細(xì)胞經(jīng)過鑒定比酶消化法得到的細(xì)胞更加純化。本實驗改進(jìn)上述方法先使用比膠原酶更廉價的胰蛋白酶進(jìn)展屢次消化胰蛋白酶僅能消化骨小梁外表細(xì)胞周圍的基質(zhì)，而對于埋藏于骨基質(zhì)中的大量靜止骨細(xì)胞無作用。前5次胰蛋白酶消化液中含有骨組織中殘留的血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓細(xì)胞及部分成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，因此棄之不用。剩余的骨片再用胰蛋白酶消化，無細(xì)胞釋放，證實骨片中僅含有埋藏于基質(zhì)中的骨細(xì)胞，而無其它細(xì)胞。骨片在培養(yǎng)液中浸泡后，靜

10、止骨細(xì)胞通過骨小管內(nèi)細(xì)胞縫隙連接11感知外界溶液濃度變化特別是鈣離子濃度變化10開場活潑起來通過骨細(xì)胞性溶骨作用12釋放出來在骨片周圍形成貼壁細(xì)胞但一般要經(jīng)過2周以上時間且貼壁細(xì)胞僅出現(xiàn)于骨片周圍10數(shù)量有限。在骨細(xì)胞釋放出來以前再次使用胰蛋白酶可大大加速其釋放速度和數(shù)量既代替了膠原酶的作用又可防止成纖維細(xì)胞的混入。消化細(xì)胞接種后，經(jīng)23周培養(yǎng)可達(dá)集合取第2、3代細(xì)胞檢測，可防止長期培養(yǎng)，反復(fù)傳代后引起細(xì)胞分化和表型的改變。本實驗結(jié)果顯示，此方法簡單、實用，并可獲得足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞。二、成骨細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的鑒別骨組織消化后的上清液中，除成骨細(xì)胞外，不可防止的混有骨髓中的血細(xì)胞及成纖維細(xì)胞。

11、血細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，換液后即可去除。成纖維細(xì)胞與成骨細(xì)胞來源一樣，同為貼壁細(xì)胞，且生長極迅速，很快取代成骨細(xì)胞。ng和hn9的研究證實，用膠原酶消化6次后，可根本消除成纖維細(xì)胞；rbey和terine10的研究說明，膠原酶消化所得細(xì)胞均含有成纖維細(xì)胞，骨片培養(yǎng)所得成骨細(xì)胞可消除成纖維細(xì)胞。因此，消化后的成骨細(xì)胞主要與成纖維細(xì)胞鑒別。成骨細(xì)胞為間質(zhì)來源細(xì)胞，具有強(qiáng)大分泌功能骨基質(zhì)成分幾乎都由成骨細(xì)胞分泌。因此，在生長旺盛期，骨細(xì)胞在相差顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞體積較大，呈鱗片狀，胞漿豐富，多偽足7。透射電鏡下，其胞核較幼稚，胞漿內(nèi)幾乎都被粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)占據(jù)，表現(xiàn)出旺盛分泌功能，這是電鏡下區(qū)別于其它細(xì)胞的形態(tài)

12、特征13。成纖維細(xì)胞分泌才能較差，細(xì)胞一般呈梭形，兩端具有細(xì)長突起，胞體無偽足。四環(huán)素與沉積的鈣鹽有特殊的親合力，常用來標(biāo)記體內(nèi)形成的新骨，在熒光顯微鏡下，成骨細(xì)胞形成的新骨經(jīng)標(biāo)記后呈現(xiàn)特征性的金黃色。除以上形態(tài)學(xué)觀察外，還可通過檢測骨細(xì)胞特征性分泌物鑒別成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。n為成骨細(xì)胞特征性分泌物，除牙本質(zhì)外，至今未在其它組織中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。n是一類維生素k依賴性、含有羧基谷氨酸的非膠原蛋白，如同在凝血酶構(gòu)造中的作用一樣，羧基谷氨酸與鈣離子有較強(qiáng)結(jié)合力因此被認(rèn)為與鈣鹽沉積和羥基磷灰石形成有關(guān)。成骨細(xì)胞分泌型膠原而無型膠原分泌，成纖維細(xì)胞同時分泌型膠原。大量akp的分泌是成骨細(xì)胞另一特征，ak

13、p有不同組織分泌的多種同工酶，檢測其骨特異性同工酶，并結(jié)合上述兩項特征性指標(biāo)，可作為鑒定成骨細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)；而成纖維細(xì)胞僅有少量akp分泌。三、型膠原的鑒別型膠原均屬于纖維狀膠原。膠原分子由3股多肽鏈組成，多肽鏈之間由共價鍵相連，型膠原由兩條1鏈和一條2鏈組成，用1()22表示；型膠原由三條1鏈組成，用1()3表示。ebster和harvey4根據(jù)膠原在不同濃度nal溶液中溶解度不同的性質(zhì)，建立了細(xì)胞培養(yǎng)液中抽提膠原的方法；laeli14建立了膠原sds復(fù)原電泳方法。膠原經(jīng)55水浴變性后，膠原纖維分解為分子，再經(jīng)巰基乙醇復(fù)原，多肽鏈之間共價鍵被翻開，樣品緩沖液中的sds是強(qiáng)陰離子集團(tuán)，與膠原分子單鏈形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，這種復(fù)合物使蛋白質(zhì)喪失了原有電荷狀態(tài)和構(gòu)象差異，各鏈在電場中挪動速率僅與分子量有關(guān)，在(15200)103道爾頓之間，遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系