微生物實驗二(2)1

1、醫(yī)學微生物學實驗 Tel: Email:新鄉(xiāng)醫(yī)學院微生物學教研室：3029130 科教科：30299451內(nèi) 容 提 要一. 內(nèi)毒素（LPS）的檢測二. 腸道致病菌的分離培養(yǎng)三. 細菌在自然界的分布及理化因素對細菌生長的影響2（一）內(nèi)毒素的檢測 目的 1 掌握內(nèi)毒素實驗的原理和操作方法。 2 熟悉內(nèi)毒素實驗的意義。3檢測內(nèi)毒素的方法有家兔發(fā)熱法和鱟（hu）實驗法，家兔發(fā)熱法比較煩瑣，且靈敏度不高，故現(xiàn)在多用鱟實驗法，鱟實驗法靈敏度高，可檢測小于10ng/ml的內(nèi)毒素。456內(nèi)毒素生物學活性：致熱作用、白細胞反應、感染性休克 和DIC等。 原理： 鱟是一種海洋節(jié)肢動物，其血液中含有一種有核變形細

2、胞，這種細胞的胞漿中含有凝固酶原和凝固蛋白原。 內(nèi)毒素（LPS）激 活 凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解狀態(tài)） （凝膠狀態(tài)）凝固酶原凝固酶7材料： 鱟試劑 內(nèi)毒素試劑 鱟試劑專用溶解水 無菌無熱源質(zhì)吸管8方法： （每4個人一組，兩支鱟試劑，一支實驗一支對照） 1.取兩支鱟試劑打開，分別加入0.1ml 鱟試劑溶解水，使之溶解 2.其中一支加入0.1ml內(nèi)毒素，標記上實驗組，另一支加入0.1ml溶解水，作為對照 3.垂直放入37溫箱，20-30分鐘觀察結(jié)果結(jié)果： 實驗組出現(xiàn)凝固，對照組不出現(xiàn)凝固9內(nèi)毒素檢測的應用： （1）檢測輸液用品或生物制品中是否 含有內(nèi)毒素 （2）臨床上檢測患者是否有革蘭氏陰性

3、菌感染引起的內(nèi)毒素血癥（內(nèi)毒素 休克）等10二. 腸道致病菌的分離培養(yǎng)2學時11一.常見培養(yǎng)基的特性及用途二.致病性腸道桿菌的生物學性狀三.分離培養(yǎng)方法 腸道細菌的分離培養(yǎng)12一、培養(yǎng)基 概念:是人工配制的專供微生物生長繁殖的混合營養(yǎng)物 制品。 成分：充足的營養(yǎng)物質(zhì)（水分、碳源、氮源、無機 鹽）；合適的 PH，適宜的溫度；適宜的氣體 環(huán)境。 用途：用于微生物的繁殖及分離接種，傳代或保存， 鑒別微生的類屬，研究微生物的生理及生化特 性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制劑等。13二、分類主要用于增菌用于檢測動力及保存菌種用于分離鑒定細菌14雙糖鐵培養(yǎng)基S-S培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基血液瓊脂培養(yǎng)基 庖肉培養(yǎng)

4、基15培養(yǎng)基的制備程序調(diào)配 過濾 矯正pH（7.0-7.6） 分裝過濾 滅菌（121.3，20-30分鐘） 鑒定是否有菌 放入冰箱冷藏備用因高壓之后pH值會下降0.1左右，所以矯正pH時應比所需的pH高鑒定是否有菌可將培養(yǎng)基置于37 培養(yǎng)24小時，然后觀察16肉湯培養(yǎng)基制作方法1.將已去筋膜及脂肪并經(jīng)絞碎的鮮牛肉50克，加蒸餾水100ml，放入冰箱中過夜。2.加熱煮沸半小時至一小時后，用數(shù)層紗布或濾紙過濾，濾液用蒸餾水補足其量為100 ml。3.于濾液中加入氯化鈉0.5克，蛋白胨1克，磷酸氫二鉀0.1克，加熱使之完全溶化。174.測定酸堿度并調(diào)至pH7.6，必要時用濾紙過濾。5.按需要分裝于試

5、管或燒瓶內(nèi)，加棉塞，置高壓蒸汽滅菌器內(nèi)，經(jīng)121.3、20-30分鐘滅菌。6.滅菌后置37溫箱孵育24小時，無雜菌生長，即可應用或放冰箱備用。18液體培養(yǎng)基加入1-2%的瓊脂為固體培養(yǎng)基，加入0.5%瓊脂為半固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基加入血液即為血平板（營養(yǎng)培養(yǎng)基）。 19血液瓊脂培養(yǎng)基（血平板）在普通瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入血液制備而成,是最常用的營養(yǎng)培養(yǎng)基,可供營養(yǎng)要求較高的細菌生長.常用于分離培養(yǎng)和溶血現(xiàn)象觀察.20含有膽酸鹽抑制G+,枸櫞酸鈉和煌綠能抑制大腸桿菌,致病的沙門菌和志賀菌能大量生長.含有中性紅指示劑和乳糖,中性紅遇酸變粉紅.常用于培養(yǎng)腸道致病菌.SS培養(yǎng)基（Salmonella

6、-Shigella Mediun）21SS培養(yǎng)基22腸道桿菌的生物學性狀埃希菌屬：大腸埃希菌沙門菌屬：傷寒沙門菌 甲型、乙型副傷寒沙門菌志賀菌屬：痢疾志賀菌腸桿菌科重要菌屬及代表菌種231 大腸桿菌: 生物學性狀: G- 鏡下為桿狀， 多數(shù)菌株有周鞭毛，菌毛，無芽孢，兼性厭氧 營養(yǎng)要求不高,可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長，發(fā)酵葡萄糖等,產(chǎn)酸產(chǎn)氣 最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.4腸道桿菌的生物學性狀24菌落特點： 圓形，凸起，灰白色，表面光滑，濕潤，直徑2-3mm25腸產(chǎn)毒型大腸桿菌（輕度腹瀉，腸毒素， 定植因子）腸侵襲型大腸桿菌（與志賀菌相關(guān)，與菌痢相似 里急后重， 不產(chǎn)生腸毒素）腸致病型大腸

7、桿菌（最早發(fā)現(xiàn)的引起腹瀉的 大腸桿菌，嬰幼兒）腸出血型大腸桿菌（出血性結(jié)腸炎和溶血性 尿毒綜合征的病原體， 輕 度水瀉伴劇烈腹痛血便， 常見食品污染）腸集聚型大腸桿菌（嬰兒和旅行者持續(xù)水樣腹瀉 偶有血便，不侵襲細胞， 在細胞表面自動聚集，形成 磚樣排列）分類：（胃腸炎）26（2）傷寒桿菌生物學特性: G-鏡下為桿狀,有菌毛，除個別外都有周鞭毛，一般無莢膜，均無芽孢。兼性厭氧，營養(yǎng)要求不高,不發(fā)酵乳糖或者蔗糖，對葡萄糖，麥芽糖，甘露糖發(fā)酵，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，其他沙門菌產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長最適宜溫度為37度,最適宜pH為7.427菌落特點: 圓形,凸起,無色，細小，半透明,表面光滑,濕潤,

8、直徑2-3mm.281、相似的形態(tài)染色從形態(tài)上無法區(qū)別 中等大小的G-桿菌 多有鞭毛、菌毛腸道桿菌的生物學性狀292、活潑的生化反應腸道桿菌的生物學性狀乳糖發(fā)酵試驗初步鑒別腸道致病菌和腸道非致病菌腸道致病菌腸道非致病菌多數(shù)不發(fā)酵乳糖 多數(shù)發(fā)酵乳糖30腸道桿菌的生物學性狀 -/+ - +傷寒桿菌 - - +痢疾桿菌 - 大腸桿菌硫化氫乳糖葡萄糖菌名31 將糞便標本以分區(qū)劃線法接種到SS培養(yǎng)基。 (每個實驗室8個平板） (接種好后，做好標記，用膠布按班綁好) 放入37溫箱中培養(yǎng)24小時。取出放4冰 箱中保存?zhèn)溆?。分離培養(yǎng)方法32三、消毒滅菌（2學時）1. 細菌在自然界的分布及理化因素 對細菌的影響

9、2. 高壓蒸汽滅菌法33空氣中細菌的檢查（每個班1個平皿） 原理：根據(jù)空氣中攜帶有微生物氣溶膠（以固體或液體微小顆粒分散于空氣中的分散體系稱為氣溶膠，其中的氣體是分散介質(zhì)）粒子在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到瓊脂培養(yǎng)基上。 方法：在室內(nèi)選擇一處放一個平皿。揭開皿蓋，皿蓋扣置于皿底下，暴露放置15min，即蓋上皿蓋，放入37 培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。1.1 細菌在自然界的分布341.2.1紫外線對細菌的影響（每個實驗室1個培養(yǎng)皿） 原理：紫外線主要作用于DNA，使一條DNA鏈上的兩個相鄰胸腺嘧啶以共價鍵結(jié)合成二聚體，從而干擾DNA的復制與轉(zhuǎn)錄導致細菌變異或死亡。對病毒也有破壞作用。 紫

10、外線殺菌作用強，而穿透能力弱。普通玻璃、紙張、水蒸氣、塵埃等均能阻擋。 紫外線中波長為240-300nm者具有殺菌能力，其中265-266nm的殺菌作用最強。 常用于消毒物體表面，手術(shù)室無菌實驗室，傳染病房的空氣消毒及不耐熱物品消毒。1.2理化因素對細菌的影響35紫外線對細菌的影響 取一個平皿，用密涂法將細菌涂布于培養(yǎng)皿中，然后按圖所示揭開平皿蓋，置于紫外線下照射30分鐘，然后蓋好蓋子，置37培養(yǎng)24h后取出觀察結(jié)果。36 1 促進菌體蛋白質(zhì)變性或凝固。 2 干擾細菌酶系統(tǒng)和代謝。 3 損傷細菌的細胞膜，影響細菌的化學組成，物理 結(jié)構(gòu)和生理活動，從而發(fā)揮防腐、消毒至滅菌作用。 1.2.2化學消

11、毒劑對細菌的影響37 有些化學藥品濃度高時能殺滅病原微生物， 稱為化學消毒劑； 濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑； （只能外用，對細菌的敏感性不同）化學消毒劑對細菌的影響38化學消毒劑分類1 高效消毒劑：殺滅細菌芽孢在內(nèi)的所有微生物，適用于不 耐熱力滅菌但要進入人體內(nèi)部的物品，如內(nèi) 窺鏡等。 次氯酸鈉、過氧化氫、甲醛、環(huán)氧乙烷等2 中效消毒劑：不能殺滅芽孢，但能殺滅繁殖體（包括結(jié)核 桿菌），真菌和大多病毒，如喉鏡，麻醉器材 碘酊、乙醇等3 低效消毒劑：能殺滅大多細菌繁殖體，但不能殺滅芽孢， 結(jié)核桿菌及某些抵抗力強的真菌和病毒。 新潔爾滅、洗必泰、高錳酸鉀等39影響消毒滅菌的因素1 微生物的種

12、類2 微生物的污染程度3 環(huán)境中的有機物4 消毒劑的性質(zhì)、濃度與作用時間5 溫度、濕度、酸堿度6 化學拮抗物40化學消毒劑對細菌的影響方法：取一普通平皿培養(yǎng)基，一部分寫上“前”，另一部分寫上“后”，然后將手指在寫有“前”的部分沾一下，再將手指用酒精進行消毒，在寫有“后”的部分沾一下。放入37溫箱培養(yǎng)24小時后觀察。 （每個實驗室2個平皿）41方法：用“打咳法”進行檢查。 取一個血瓊脂平皿培養(yǎng)基（咽喉部多為葡萄球菌），打開平皿蓋，對著平皿咳嗽幾次（口腔前約10厘米），然后放入37溫箱培養(yǎng)24小時后觀察菌落數(shù)量及特征。 咽喉部細菌的檢查422 高壓蒸氣滅菌法 原理：蒸汽被限制在密閉容器內(nèi)，隨著熱力

13、的作用壓力不斷升高，蒸汽的溫度也相應升高，在103.4kPa蒸汽壓力下時，溫度可達121.3。維持1520分鐘后可殺死細菌包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。43高壓蒸氣滅菌器1)構(gòu)造 高壓蒸氣滅菌器是一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水，外層堅厚，其上或前方有金屬厚蓋。蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸氣不能外溢。 高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥，以調(diào)節(jié)器內(nèi)壓力，裝有的溫度計及壓力表以示內(nèi)部溫度和壓力。 器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌對象。44高壓蒸汽滅菌法壓力：1.05kg/ 或103.425KPa溫度: 121.3時間：15-20min完全殺滅細菌的繁殖體和芽孢用途：適用于耐高溫、高壓，不怕

14、潮濕的物品， 如敷料、 手術(shù)器械、藥品、細菌培養(yǎng)基等45全自動高壓蒸汽滅菌鍋 46Systec D-200 2D 雙門高壓滅菌器電熱臥式圓形壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-WY21-600)47臺式蒸汽滅菌器 BA-3048全自動噴淋式高溫高壓調(diào)理殺菌鍋49 電腦全自動水浴式串聯(lián)殺菌鍋502)使用方法 加水至鍋內(nèi)達規(guī)定的水平面，放人欲滅菌物品，把鍋蓋按對稱的螺旋先后對稱用力（切勿單個依次）扭緊，使鍋蓋確實均勻密閉。 用電爐加熱，同時打開排氣閥門，使器內(nèi)冷空氣逸出，保證器內(nèi)溫度和壓力表所示一致。待空氣全部排出后，關(guān)閉排氣閥。 繼續(xù)加熱注視壓力表，器內(nèi)壓力又逐漸升高，直到壓力表指在所需數(shù)字（例如15磅）即調(diào)節(jié)熱源，維持2030min可完全殺死細菌的繁殖體和芽胞。 滅菌時間到達后，停止加熱，待壓力自行下降至零時方可徐徐開放排氣閥，排盡余氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品。513